Методы, основанные на испускании излучения

Государственный Университет Медицины и Фармации

Им. Н. Тестемицану

 

 

КАФЕДРА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

 

Физико-химические методы в количественном анализе

лекарственных средств

 

Методическое указание для студентов V курса по циклу «Контроль качества лекарств»

 

 

Кишинэу 2006

 

 

Введение

Современные физико-химические методы анализа имеют ряд преимуществ перед классическими химическими методами. Они основаны на использовании как физических, так и химических свойств веществ в большинстве случаев отличаются экспресностью, избирательностью, высокой чувствительностью, возможностью унификации и автоматизации.

Важной особенностью физико-химических методов является объективность оценки качества лекарственного вещества по фармакологически активной части молекулы. В последние годы эти методы все шире применяются в практику работы в области стандартизации и контроля качества лекарственных средств.

Физико-химические используют для определения подлинности, доброкачественности (степени чистоты) и для количественного определения.

 

Цель. Закрепить навыки методологического подхода к количественному анализу лекарственных средств, с помощью физико-химических методов.

 

Целевые задачи:

1. Сформировать методологический подход к проведению количественного анализа лекарственных средств, с помощью физико-химических методов.

2. Освоить практические навыки по проведению количественного анализа лекарственных средств, с помощью физико-химических методов.

 

План изучения темы

На изучение темы отводится два занятия.

 

Форма занятия:

Ø Теоретическая подготовка к выполнению целевых задач;

Ø Практическая лабораторная работа;

Ø Итоговый контроль.

 

Информационный материал

Химические методы анализа не в состоянии удовлетворить многообразные запросы возникающие в процессе установления структуры вещества, определения его качества и стандартизации.

Развитие полупроводниковой промышленности, электроники позволило снизить предел обнаружения до 10^-5…10^-10%. Определение столь малых содержаний гравиметрическим или титриметрическим методами практически невозможно, и только применение физико-химических методов анализа, обладающих гораздо более низким пределом обнаружения, позволяет решать аналитические задачи такого рода.

Важными особенностью физико-химических методов анализа являются: экспресность, высокий темп получения результатов, проводение анализа на расстоянии, автоматизация самого процесса анализа, выполнение анализа без разрушения анализируемого образца (недеструктивный анализ).

Погрешность анализа физико-химическими методами составляет в среднем 2-5%, что превышает погрешность классических методов анализа.

Физико-химическиеметоды приобретают все большее значение для объективной оценки качества лекарственных средств, в т.ч. для испытания на подлин­ность, на чистоту и для количественного определения.

 

Следует отметить также, что погрешность анализа физико-химическими методами имеет тенденцию снижаться за счет конструирования современных аналитических приборов и разработке более совершенных аналитических методик.

Однако химические методы анализа своего значения не потеряли, они незаменимы там, где при высоком содержании требуется высокая точность и нет серьезных ограничений во времени (например, анализ готовой продукции арбитражный анализ, изготовление эталонов).

Существенным недостатком большинства физико-химических методов является то, что для их практического применения требуются эталоны, стандартные растворы и т.д.

Применяемые в фармацевтическом анализе физико-химические методы классифицируются на следующие группы:

I. Оптические методы:

1.1. Рефрактометрия – основана на определении показателя преломления луча света в растворе испытуемого вещества.

1.2. Поляриметрия – основана на способности раствора вещества вращать плоскость поляризованного луча света.

1.3. Интерферометрия – основана на изменении интерференции света.

II. Методы, основанные на поглощении электромагнитного излучения

(абсорбционные методы):

2.1. Колориметрия - основана на определении интенсивности светового потока прошедшего через раствор вещества визуальными способами.

2.2. Фотоколориметрия – основана на измерении интенсивности световых потоков с помощью фотоэлементов.

2.3. Спектрофотометрия – основана на способности веществ поглощать электромагнитные излучения.

2.4. Фототурбидиметрия – основана на измерении интенсивности света, поглощенного тонко­дисперсной суспензией.

2.5. Фотонефелометрия – основана на измерении света, рассеянного взвешен­ными частицами анализируемого вещества.

III. Методы основанные на испускании излучения:

3.1. Пламенно-эмиссионная спектрофотометрия – метод, в котором концентрацию элемента в растворе устанавливают по интенсивности характеристического излучения, испускаемого пламенем.

3.2. Флуоресцентный метод – основан на способности веществ флуоресцировать в УФ-свете.

3.3. Радиохимический метод – основан на измерении β- или γ- излучения с помощью спектрометров.

IV. Методы, основанные на использовании магнитного поля:

4.1. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) – основан на регистрации индуцированных радиочастотным полем переходов между ядерными магнитными энергетическими уровнями молекул вещества.

4.2. Масс-спектрометрия – основан на способности газообразных ионов разделяться в магнитном поле.

V. Электрохимические методы.

5.1. Потенциометрия – основан на измерении потенциалов, возникающих между испытуемым раствором и погруженным в него электродом.

5.2. 5.2. Полярография – основана на измерении силы тока, возникающего при электроокислении или электровосстановлении испытуемых веществ.

VI. Термические методы анализа

6.1. Дериватография – основаны на изменениях, которые вызывает нагревание вещества.

VII. Методы разделения (хроматография).

Хроматографические методы разделения веществ основаны на их распределении между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Данные методы можно классифицировать по следующим признакам:

7.1. По механизму процесса разделения:

- ионообменная

- адсорбционная

- осадочная

- распределительная

- окислительно-восстановительная

7.2. По форме проведения процесса:

- колоночная

- капиллярная

- плоскостная

7.3. По агрегатному состоянию:

- газо-адсорбционная

- газо-жидкостная

- жидкость-жидкостная

 

-

 

Оптические методы

Рефрактометрия основана на наличии зависимости величины показателя преломления света от концен­трации раствора испытуемого вещества. Показатель преломления зависит также от температуры, длины волны света, концентрации вещества и природы растворителя. Рефрактометрию используют для установления подлинно­сти лекарственных веществ по молярной рефракции. Для количественного определения выбирают интервал ли­нейной зависимости между концентрацией раствора и коэффициентом преломления. В этом интервале концентра­цию (х) вычисляют по формуле: х = (n — n_о)/F, где n — показатель преломления раствора вещества; n_о — показатель преломления растворителя; F — фактор, равный величине прироста показателя преломления при уве­личении концентрации вещества на 1% (устанавливается экспериментально).

Рефрактометрические определения выполняют на рефрактометрах, при стабильной температуре (20±0,3°С) и длине волны линии Dспектра натрия (589,3 нм) в диапозоне показателей преломления от 1,3 до 1,7. Прибор юстируют по эталонным жидкостям или воде очищенной, для которой n_D²⁰ = 1,3330.

Поляриметрия — метод, основанный на способности вещества вращать плоскость поляризованного света. Эта способность обусловлена наличием в молекулах ассиметрических атомов углерода. Степень отклонения плоскости поляризации от первоначального положения выражается в угловых градусах. Эту величину называют углом вращения (α). Правовращающие вещества вращают плоскость поляризации по часовой стрелке (обозначают знаком +), левовращающие — против часовой стрелки (—).

Для растворов величина α зависит от природы растворителя, концентрации оптически активного вещества и длины рабочего слоя кюветы с раствором. Подлинность и чистоту лекарственных веществ подтверждают по ве­личине удельного вращения [α]_D²⁰, измеренного при 20°С и длине волны D спектра натрия. Величину [α]_D²⁰ для растворов веществ рассчитывают по формуле:

 

α · 100

[α]_D²⁰ = -----------

l · C

где α — измеренный угол вращения, в градусах; (l — длина рабочего слоя кюветы, в дециметрах; С — концентра­ция раствора вещества (г/100 мл).

Количественное содержание (в %) оптически активного вещества в растворе определяют по формуле:

. α · 100

C = -----------

[α]_D²⁰ · l

 

Величину α измеряют на поляриметрах с точностью до ±0,02°.

 

Методы, основанные на поглощении электромагнитного излучения

Используют спектрофотометрические методы анализа по поглощению веществами монохроматического электромагнитного излучения (в УФ-, видимой- и ИК-области) и фотоколориметрические (колориметрические) методы ана­лиза по поглощению веществами немонохроматического излучения.

Фотометрические методы анализа основаны на использовании объединенного закона Бугера-Ламберта-Бера:

lg I₀ /I = А= χ· c · l

где -I₀ — интенсивность излучения, падающего на вещество; I — интенсивность излучения, прошедшего через ве­щество; А — величина абсорбции (оптической плотности); χ — показатель поглощения данного вещества; С — концентрация раствора анализируемого вещества, г; l —длина рабочего слоя кюветы, см.

На основании этого закона содержание вещества в растворе определяют по формуле:

 

А

C = -----------

χ· l

В случае несоответствия закону Бугера-Ламберта-Бера вначале с помощью стандартного раствора уста­навливают зависимость оптической плотности от концентрации, а затем строят калибровочный график, с помощью которого выполняют расчеты.

Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях — один из наиболее широко используемых фи­зико-химических методов в фармацевтическом анализе.

Анализируемые лекарственные вещества должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи, аро­матическое ядро и др.), обуславливающие различные электронные переходы в молекулах и поглощение электро­магнитного излучения.

Кривая зависимости интенсивности светопоглощения от длины волны (нм) называется спектром поглоще­ния вещества и является его специфической характеристикой.

Измерение спектров поглощения растворов анали­зируемых веществ в ультрафиолетовой (190-380 нм) и видимой (380-780 нм) областях производят с помощью спектрофотометров различных марок (СФ-26, СФ-46 и др.). В качестве растворителей используют свободные от примесей воду, растворы кислот и щелочей, этанол, хлороформ и другие органические растворители.

 

Спектрофотометрической константой является величина специфической абсорбции (удельный показатель поглощения) (А^1%_1см), который рассчи­тывают по формуле:

 

А

А^1%_1см = -----------

С· l

Специфическая абсорбция А^1%_1смпредставляет собой величину оптической плотности раствора, со­держащего 1,0 г вещества в 100 мп раствора, измеренную в кювете с рабочей длиной 1 см. Установив по стандарт­ному образцу величину А^1%_1сми преобразовав эту формулу, можно рассчитать концентрацию анализируемого веще­ства с относительной погрешностью до ±2%.

Идентификацию лекарственных веществ можно провести по А^1%_1см, характеру спектральных кривых в различных растворите­лях, положению максимума и минимума светопоглощения или их отношению (при различных длинах волн). Для количественного спектрофотометрического анализа важен выбор аналитической полосы поглощения. Последняя должна быть свободна от наложения полос поглощения других компонентов смеси и иметь достаточно высокий удельный показатель поглощения анализируемого вещества.

Фотоколориметрия отличается от спектрофотометрического анализа тем, что анализируемое вещество с помощью какого-либо реагента переводят (количественно) в окрашенное соединение. Вначале получают окра­шенные растворы, используя растворы стандартных образцов (ГСО или РСО). Измерение оптической плотности производят на фотоколориметрах. Затем строят калибровочный график зависимости интенсивности поглощения окрашенных растворов от концентрации, по которому рассчитывают содержание лекарственных веществ в испытуемых образцах лекарственных веществ или лекарственных форм.

Метод дифференциальной спектрофотометрии и фотоколориметрии основан на измерении светопоглощения анализируемого раствора относительно раствора сравнения, содержащего определенное количе­ство стандартного образца испытуемого вещества или его заменителя. Такой прием приводит к изменению рабочей области шкалы прибора и снижению относительной погрешности определения до ±0,5-1%, т.е. сопоставимой с титриметрическими методами.

Производная УФ-спектрофотометрия является одним из вариантов дифференциальной спектрофотометрии. Если в дифференциальной спектрофотометрии используют разность оптических плотностей при одной и той же длине волны, то в производной — при двух длинах волн, разделенных небольшим интервалом. Этот вари­ант основан на выделении индивидуальных полос из УФ-спектра, который представляет собой сумму налагаю­щихся полос поглощения или полос, не имеющих четко выраженного максимума. При этом на спектральных кри­вых в координатах: производная-длина волны появляются полосы с отчетливо выраженными максимумами и минимумами. Благодаря этому можно идентифицировать сходные по химической структуре вещества, повысить избирательность анализа и выполнять количественное определение двух-, трехкомпонентных смесей более эконо­мично и эффективно, чем титриметрическими методами.

Одним из вариантов дифференциальной спектрофотометрии является ΔЕ-метод. Он основан на превра­щении одного из веществ, входящих в состав анализируемой пробы, в таутомерную (или иную) форму, отличаю­щуюся по характеру и интенсивности светопоглощения. Затем измеряют светопоглощение раствора одной таутомерной формы по отношению к другой, т.е. используют в качестве стандарта раствор анализируемого вещества.

Спектрофотометрия в ИК-области. Природа полос поглощения в ИК области связана с колебатель­ными переходами и изменением колебательных состояний ядер, входящих в молекулу поглощающего вещества. Поэтому поглощением в ИК-области обладают молекулы, дипольные моменты которых изменяются при возбуж­дении колебательных движений ядер. Область применения ИК-спектроскопии аналогична, но более широка, чем у УФ-метода. ИК-спектр однозначно характеризует всю структуру молекулы, включая незначительные ее измене­ния. Важные преимущества ИК-спектроскопии — высокая специфичность, объективность полученных результа­тов, возможность анализа веществ в кристаллическом состоянии. Для измерения ИК-спектров на однолучевых или двулучевых ИК-спектрофотометрах используют взвеси веществ в вазелиновом масле или помещают анализируе­мое вещество между пластинами из бромида калия. Каждый ИК-спектр представляет собой серию полос поглоще­ния, максимумы которых определяются волновым числом, измеряемым в см^-1, и определенной интенсивностью. Для анализа лекарственных веществ обычно используют спектральную область от 4000 до 400 см^-1.

 

см^-1

 

Рис.1. ИК-спектр прокаина (новокаин) гидрохлорида.

 

ГФ XI рекомендует два способа установления подлинности по ИК-спектрам. Один из них основан на срав­нении зарегистрированных в идентичных условиях ИК-спектров испытуемого лекарственного вещества и его стандартного образца. Второй способ заключается в сравнении ИК-спектра испытуемого лекарственного вещества с его стандартным спектром, прилагаемым к АНД и зарегистрированным в соответствии с указанными в ней требованиями.

Фототурбидиметрия — метод, основанный на измерении интенсивности света, поглощенного тонко­дисперсной суспензией, и фотонефелометрия — метод, основанный на измерении света, рассеянного взвешен­ными частицами анализируемого вещества. Оба метода применяют в фармацевтическом анализе для количествен­ного определения лекарственных веществ, образующих с различными реактивами тонкие суспензии. Предварительно устанавливают зависимость между интенсивностью поглощения (рассеяния) света и концентрацией вещества в анализируемом растворе. Способы расчета аналогичны фотометрическим методам.

Методы, основанные на испускании излучения

Атомно-абсорбционная спектрометрия основана на поглощении атомами излучения с частотой, равной частоте резонансного перехода. Излучение исходит от лампы с полым катодом, проходит через пламя, в котором распыляется проба, пропускается через щель монохроматора, и выделенная из спектра резонансная линия определяемого элемента измеряется фотоэлектрическим способом. Затем устанавливается зависимость между ос­лаблением интенсивности излучения источника света и концентрацией испытуемого вещества.

Флуоресцентные методы основаны на способности веществ флуоресцировать в УФ-свете, обуслов­ленной либо химической структурой самих органических веществ, либо продуктов их диссоциации, сольволиза, других превращений. Способностью флуоресцировать обладают обычно органические соединения с симметричной структурой молекул, в которых имеются сопряженные связи (нитро-, нитрозо-, азо-, амидные, карбонильные или карбоксильные группы).

Флуориметрия используется не только для установления подлинности, но и определения малых коли­честв веществ, т.к. интенсивность флуоресценции имеет линейную зависимость от концентрации. Линейная зави­симость сохраняется при постоянстве квантового выхода и интенсивности возбуждающего света для низких кон­центраций веществ. При высоких концентрациях эта зависимость нарушается. Идентификацию проводят по цвету излучаемого света, специфичного для флуоресцирующих веществ. Спектр дает широкие полосы излучения (от 100 до 200 нм). Метод отличается очень высокой чувствительностью. Количественное определение выполняют на спектрофлуориметрах. Расчет концентрации производят с помощью калибровочного графика или шкалы стандарт­ных растворов, аналогично фотометрическим методам.