Лабораторная работа «Определение количества гемоглобина»
Дыхательным пигментом многих животных является гемоглобин (Нb), который содержится у теплокровных позвоночных в красных кровяных тельцах, составляя до 90% сухого веса последних. Важнейшая физиологическая роль гемоглобина - перенос кислорода. Гемоглобин относится к группе сложных белков, его молекула состоит из белковой части (глобин) и небелковой части - гема. Молекула гема содержит 1 атом двухвалентного железа. Структура гема у всех животных практически одинакова. Особенности гемоглобина животных разных видов определяются структурой глобина. Гемоглобин теплокровных имеет молекулярную массу 64000-68000 и через оболочку эритроцитов не проникает.
У некоторых беспозвоночных животных (кольчатые черви, моллюски отдельных видов) кислород также связывается и переносится с помощью гемоглобина. Однако у этих животных гемоглобин находится не в клетках, а растворен в гемолимфе.
Содержание гемоглобина у взрослого человека 13-18,5%, у женщин несколько меньше, чем у мужчин. Указанная величина означает, что каждые 100 мл крови содержат 13-18,5г Hb.
Определение количества Hb у человека имеет диагностическое значение для распознавания малокровия и других заболеваний. Количество Hb в крови может быть найдено, например, по количеству связываемого им кислорода, по интенсивности окраски кровяного пигмента. Наиболее распространен последний способ (колориметрический). Обычно для определения гемоглобина этим способом пользуются простейшим колориметром - гемометром Сали.
Средняя норма количества Hb для лягушки 53 ед. по Сали, при отклонениях от 45 до 66 ед.
Цель работы. Знакомство с основными принципами подсчета содержания гемоглобина в крови.
Оборудование, материалы и объект исследования. Гемометр Сали, 0,1 N раствор HCl, дистиллированная вода, пипетка для взятия крови.
Ход работы.
Знакомятся с устройством гемометра Сали. Гемометр Сали представляет собой штатив, задняя стенка которого сделана из матового стекла, с тремя гнездами. В боковые гнезда помещены запаянные пробирки с 1%-ным раствором солянокислого гематина или стеклянные палочки стандартной окраски. В среднее гнездо вставлена открытая пустая градуированная пробирка для исследуемой крови, которая имеет 2 шкалы, нанесенные с обеих сторон пробирки. Первая шкала градуирована в единицах Сали (ед. Сали), вторая – в грамм-процентах (г -%). Шкалы соотносятся между собой следующим образом: 100 ед. Сали = 16.67 г -%.
В среднюю пробирку гемометра Сали до нижней метки наливают 0,1 N раствор HCl.
В капиллярную пипетку набирают 0,2 мл крови, излишний объем крови удаляют, прикладывая ватку к кончику капилляра.
Кровь из капилляра выдувают на дно средней пробирки, смешав её с кислотой. Кровь гемолизируется, и образовавшийся солянокислый гематин придает ей коричневый оттенок.
Через 5-10 мин к содержимому пробирки по капле добавляют дистиллированную воду до тех пор, пока при рассматривании в проходящем свете его окраска не сравняется с окраской стандартных пробирок. При добавлении воды содержимое пробирки размешивают стеклянной палочкой. При рассматривании раствора стеклянную палочку вынимают из него, но не из пробирки. Цифра, стоящая на уровне нижнего мениска жидкости, укажет количество гемоглобина в грамм-процентах или единицах Сали.
Оформление работы. Записывают результаты (по обеим шкалам) вычисленного процентного содержания гемоглобина в крови и сравнивают его с нормой.
Лабораторная работа «Подсчет количества эритроцитов»
Абсолютное количество эритроцитов во всем объеме крови животного организма определить трудно. Поэтому число форменных элементов определяют в 1 мм3 цельной крови. У человека в этом объеме содержится 4,5-5 млн эритроцитов. В организме среднее количество эритроцитов удерживается на постоянном уровне. Распад одних эритроцитов и образование новых совершаются непрерывно, одновременно и взаимно уравновешенно.
Для облегчения подсчета форменных элементов под микроскопом кровь разбавляют в 100 раз, используя специальный прибор, называемый смесителем. Смеситель для подсчета количества эритроцитов представляет собой капилляр, в верхней части имеющий шарообразное расширение. В образующей это расширение части капилляра имеется палочка, которая механически размешивает кровь в разбавляющей жидкости для равномерного распределения форменных элементов. В смесителях для эритроцитов палочка окрашена в красный цвет. На капилляре смесителя имеются метки 0,5 и 1,0; которые обозначают половину и целый объем капилляра. Выше шарообразного расширения метка 101 в смесителе для эритроцитов означает, что полость расширения имеет объем в 100 раз больший, чем объем полости капилляра.
Цель работы. Знакомство с техникой подсчета эритроцитов.
Оборудование, материалы и объект исследования. Счетная камера Горяева, смеситель для эритроцитов, покровное стекло, 2%-ный раствор NaCl, вата.
Ход работы.
Знакомятся с устройством счетной камеры Горяева. Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с желобками, разграничивающими три поперечно расположенных площадки. Средняя из площадок разделена поперечным желобком на две половины, на каждой из них нанесена сетка. Боковые площадки на 0,1 мм выше средней и служат для притирания покровного стекла, под которым над сетчатой поверхностью остается пространство в 0,1 мм высотой. Сетка камеры состоит из 225 больших равных по площади квадратов. Из них 25 разделены на 16 маленьких. Сторона маленького квадрата = 1/20 мм, а его площадь 1/20х1/20=1/400 мм2.
Объем крови над одним маленьким квадратом = 1/400х1/10=1/4000 мм3. Рассматривают сетку счетной камеры под микроскопом. Накрывают среднюю площадку покровным стеклом и притирают его к боковым площадкам до появления радужных полос.
В часовое стекло наливают около 1 мл 2%-ного раствора NaCl.
В смеситель набирают кровь без пузырьков воздуха до метки 1. Кровь, приставшую к кончику смесителя, снимают ватой, а затем быстро, но осторожно, добирают в смеситель 2%-ный раствор NaCl из часового стекла до метки 101 (кровь при этом разводится в 100 раз).
Держа смеситель между двумя пальцами горизонтально, встряхивают его в течение 3 мин для перемешивания крови с раствором.
Из капиллярной части смесителя выдувают первые 2-3 капли жидкости на вату, а следующую каплю наносят на среднюю пластину камеры Горяева у края покровного стекла. Камера под покровным стеклом работает как капилляр, и капля заполнит обе половины камеры.
Камеру помещают на предметный столик микроскопа и через 3-4 мин приступают к подсчету эритроцитов в 80 маленьких квадратиках (или 5 больших), взятых по диагонали или посередине сетки. Чтобы не сосчитать одни и те же эритроциты, подсчитывают все эритроциты внутри квадратика и те, которые располагаются по верхней и левой пограничной линиям.
Вычисляют среднее количество эритроцитов в одном маленьком квадратике, а затем рассчитывают количество эритроцитов в 1 мм3 крови.
Оформление работы. Зарисовывают картину, наблюдаемую под микроскопом. Указывают количество эритроцитов в 1 мм3 крови.