Методы биохимических исследований
Методы исследования на уровне целостного организма
Исслед. баланса веществ: соотношение между количеством поступившего в орг-м вещества и выделившихся прод-в его распада. Пример: определение баланса N, C
Изучение энергетического баланса: Определяют соотнош. между энергетической ценностью питательных веществ, в составе суточного рациона, и энергетическими тратами организма за этот же период
Изотопный метод: Введение изотопных меток («меченых» атомов) позволяет проследить путь «меченого» атома в обмене веществ. Пример: радиоиммуноанализ гормонов, присутствующих в микроколичествах.
Методы исследования на клеточном уровне
Методы экстрагирования и гомогенизации клеток: 1)Исходный материал – свежая ткань или осадок спрессованных клеток микроорганизма, получаемый центрифугированием. 2) Ткань измельчают в мясорубке (или пестиком в ступке с кварцевым песком) или в гомогенизаторе; 3) Клетки микробов разрушают с помощью ультразвука или продавливанием через пресс под высоким p; 4) Сырой гомогенат процеживают и центрифугируют; 5) Более крупные частицы клеток осаждаются при низких скоростях вращения (неразрушившиеся клетки, ядра), затем более мелкие (митохондрии, лизосомы, затем рибосомы, осколки ЭПС)
Определение в тканях и биологических жидкостях содержания отдельных соединений и продуктов их превращений
Цветные реакции. Определ.соединение с соответ. реактивом дает окраш. продукт
Спектральные и флюорометрические методы и приемы оптического сканирования: 1) воздействие на вещество электромагнитного излучения – УФ-, ИК-спектроскопия и спектроскопия ЯМР. 2)Приборы: электрофотоколориметры, спектрофотометры, спектрофлюорометры, пламенные фотометры и др. 3) Прижизненные методы: оптическое зондирование объекта позволяет во многих плоскостях («строках»), не останавливая происходящие процессы, проследить за динамикой составляющих их реакций
Методы разделения смесей веществ
Гидролиз биополимеров: 1) Почти все биополимеры нестабильны и в реакции с водой распадаются на мономеры (гидролизуются); 2) Гидролиз катализируют ионы Н+, ОН– и ферменты; 3) Гидролиз может быть полным или частичным, неспецифическим или направленным на определенные связи; 4) После гидролиза определяют структуры полученных фрагментов и выясняют структуру полимера в целом различными методами
Электрофорез: основан на различной скорости перемещения молекул в электрическом поле. Способы: -на бумаге
-гель-электрофорез: позволяет разделить молекулы и по размеру, и по электрическому заряду
Хроматография – различное распределение веществ между подвижной (поток жидкости или газа) и неподвижной (твердой или жидкой) фазами. По характеру фаз, с помощью которых производится разделение, – газовая, газожидкостная и жидкостная. По типу взаимодействия разделяемых веществ с фазами – адсорбционная, распределительная, ионообменная
Диализ и ультрафильтрация: 1) Основаны на разнице в размерах молекул; 2) Применяют тонкую полупроницаемуюмембрану, которая пропускает малые молекулы, а крупные задерживает
Гель-фильтрация (гель-хроматография, метод молекулярных сит или ситовая хроматография): 1) То же, что диализ, но в качестве барьера используется различные гели с трехмерной сетчатой структурой: декстраны (сефадекс), полиакриламиды, пористые силикагели, цеолиты и др.; 2) При разделении смеси небольшие молекулы диффундируют через поры набухшего в растворителе геля, а крупные молекулы проходят через пространство между частицами геля; 3) При промывании геля растворителем в первую очередь перемещаются крупные молекулы, а затем мелкие
Спектральные методы: 1) Разделении веществ дающих различные спектры поглощения лучей света.
Методы изучения структуры веществ
Рентгеноструктурный анализ: принцип работы рентгена.
Ядерный магнитный резонанс: 1) Поглощение электромагнитных волн в радиочастотном диапазоне ядрами атомов, обладающими магнитным моментом; 2) Поглощение кванта энергии происходит, когда ядра находятся в сильном магнитном поле ЯМР-спектрометра; 3) Различные по химическому окружению ядра поглощают энергию в несколько отличающемся по напряжению магнитном поле (или, при постоянном напряжении, несколько отличающиеся по частоте радиочастотные колебания); 4) В результате получается спектр ЯМР вещества, в котором магнитно несимметричные ядра характеризуются определенными сигналами – «химическими сдвигами» по отношению к какому-либо стандарту; 5) Спектры ЯМР дают возможность определить число атомов данного элемента в соединении и число и характер других атомов, окружающих данный
Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР): 1) Используется резонансное поглощение излучения электронами
Электронная микроскопия: Обладая разрешением ~0,4 нм, электронный микроскоп позволяет «увидеть» молекулы белков и нуклеиновых кислот, а также детали строения клеточных органелл;
Методы выделения и очистки белков: После выбора источника выделения белка, проводится экстракция его из ткани. Концентрирование. Проводят путем осажд. белка с последующим растворением осадка в меньшем объеме. Обычно при этом используют сульфат аммония или ацетон. Конц. белка в исходном растворе должна быть не меньше 1 мг/мл. Тепловая денатурация. На начальном этапе очистки для разделения белков иногда используют тепловую обработку. Она эффективна, если белок относительно устойчив в условиях нагревания, в то время как сопутствующие белки денатурируют. При этом варьируют рН раствора, продолжительность обработки и температуру. В полученной смеси белки отличаются друг от друга растворимостью, молекулярной массой, величиной суммарного заряда молекулы, относительной стабильностью и т.д. Осаждение белков органическими растворителями. Это один из старых методов. Он играет важную роль при очистке белков в промышленных масштабах. Чаще всего используют растворители-этанол и ацетон. По мере возрастания концентрации органического растворителя снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Происходит снижение растворимости белков до уровня, при котором начинается агрегация и осаждение. Важным параметром, влияющим на осаждение, является размер молекулы белка. Чем больше молекула, тем ниже концентрация органического растворителя, вызывающая осаждение белка. Гельфильтрация С помощью метода гельфильтрации можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размерами. Носителем для хроматографии является гель, играющий роль молекулярного сита. Электрофорез Молекула белка в растворе при любом рН, отличающемся от её изоэлектрической точки, имеет некий средний заряд. Белок движется в электрическом поле. Движущая сила определяется величиной напряженности электрического поля Е умноженной на суммарный заряд частицы z. Этой силе противостоят силы вязкости среды, пропорциональные коэффициенту вязкости η, радиусу частицы r и скорости v.; Е ·z = 6πηrv.
Определение молекулярной массы белка. Масс-спектрометрия (масс-спектроскопия, масс-спектрография) — метод исследования вещества путём определения отношения массы к заряду. Белки способны приобретать множественные положительные и отрицательные заряды. Атомы химических элементов имеют специфическую массу. Таким образом, точное определение массы анализируемой молекулы, позволяет определить её элементный состав. Масс-спектрометрия также позволяет получить важную информацию об изотопном составе анализируемых молекул.
Методы выделения и очистки ферментов Выделение ферментов из биологического материала – единственный реальный способ получения ферментов. Источники фермента: ткани; бактерии, выращенные на среде, содержащей соответствующий субстрат; клеточные структуры (митохондрии и др.). Необходимо сначала выделить нужные объекты из биологического материала.
Методы выделения ферментов: Экстракция (перевод в раствор): буферным раствором; высушивание ацетоном; обработка материала смесью бутанола с водой; экстракция различными органическими растворителями, водными растворами детергентов; обработка материала перхлоратами, гидролитическими ферментами (липазами, нуклеазами, протеолитическими ферментами)
Фракционирование. Факторы, влияющие на результаты: рН, концентрация электролитов. Необходимопостоянно измерять активность фермента.
-фракционное осаждение при изменении рН
-фракционная денатурация нагреванием
-фракционное осаждение органическими растворителями
-фракционирование солями – высаливание
фракционная адсорбция (А. Я. Данилевский): адсорбент вносят в раствор фермента, затем каждую порцию отделяют центрифугированием
-если фермент адсорбируется, то его отделяют, затем элюируют с адсорбента
-если фермент не адсорбируется, то обработку адсорбентом используют для отделения балластных веществ
-ферментный раствор пропускают через колонку с адсорбентом и собирают фракции
Ферменты адсорбируются избирательно:колоночная хроматография;электрофорез; кристаллизация – получение высокоочищенных ферментов.