ТЕМА 9. МЕТОДЫОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА
Цель: дать основные представления о современных методах оценки иммунного статуса. Указать основные отличия и охарактеризовать иммунодиагностические методы 1-го и 2-го уровней.
Можно выделить 2 разновидности лабораторной деятельности, имеющей отношение к иммунологии:
1. использование иммунологических методов для оценки неиммунологических показателей;
2. определение иммунологических показателей для характеристики состояния иммунной системы (иммунного статуса).
Пример деятельности первого рода - широкое использование методов иммунохимического анализа для определения гормонов и других физиологически значимых молекул в сыворотке крови и других биологических субстратах. В последние десятилетия с этой целью используют практически исключительно количественные методы иммунолигандного анализа: в недалеком прошлом радиоммунологического, и настоящее время иммуноферментного. С той же целью используют иммуноблоттинг. Преимущества иммунологических методов состоят в специфичности, высокой чувствительности, относительной простоте и дешевизне. Это направление лабораторной диагностики имеет отношение к использованию иммунологических методов, но только иногда — к решению иммунологи-ческих (т.е. собственно иммунодиагностических) задач — при определении антител, цитокинов и других молекул, непосредственно участвующих в иммунологических процессах
Одна из первоочередных задач современной иммунологии – это оценка функционирования иммунной системы в норме и при заболеваниях человека. Сложность этой проблемы обусловлена достаточно сложной, многокомпонентной организацией иммунной системы, разнообразием её структур на клеточном и молекулярном уровне, зависимостью от регуляторных сигналов со стороны нервной, эндокринной, кровеносной и многих других систем организма. Тем не менее, необходимость оценивать иммунную систему — современная реальность. К сожалению, в настоящее время не придумали единого теста для оценки иммунной системы в целом.
Методика выполнения работы
Определение фагоцитарного числа и фагоцитарного показателя invitro
Техника постановки: в небольшую пробирку наливают последовательно микропипеткой 0,05мл 2% р-ра цитрата натрия, 0,1мл испытуемой крови и 0,05мл 2-миллиардной взвеси S. Aureus (штамм 209). Тщательно перемешивают и выдерживают 30мин. При 37ºС. После этого содержимое пробирки вновь перемешивают и готовят из него тонкие мазки, которые фиксируют метанолом или смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течении 20 – 30 минут.
Препараты микроскопируют, передвигая мазок в одном направлении, подсчитывают число фагоцитированных бактерий в 50 лейкоцитах. Исходя из этого определяют среднее количество фагоцитированных бактерий на один лейкоцит.
Изучение незавершенного фагоцитоза в препаратах из отделяемого уретры больного гонореей. Результаты записать в тетрадь.
Мазки фиксируют на пламени горелки и окрашивают по Грамму (или метиленовой синькой). При микроскопии мазков отмечают наличие грамотрицательных диплококков, расположенных внутри фагоцитов (лейкоцитов). Зарисовать в тетради.
Расчет показателей фагоцитоза
1. Процент фагоцитирующих нейтрофилов (% фагоцитоза) – считают процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего количества посчитанных нейтрофилов. В норме процент фагоцитоза у взрослых -60-90%, у детей – 30-65%.
2. Фагоцитарное число – это среднее количество поглощенных бактерий или частиц на 1 клетку (полиморфно – ядерный лейкоцит).
В норме фагоцитарное число после 30 мин инкубации составляет 4,5- 7,5.
3. Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - оценивают переваривающую функцию нейтрофилов. Это отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов (переваренных и непереваренных), выраженное в процентах. Норма для взрослых - 64 – 72%.
4. Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ). В норме через 30 мин начинается переваривание поглощенных микроорганизмов нейтрофилами, через 2 ч. оно должно закончиться. Поэтому процент фагоцитирующих нейтрофилов и среднее число поглощенных микроорганизмов после 2-часовой экспозиции меньше, чем после 30 – минутной, а ИЗФ - больше 1,0, что указывает на завершенность фагоцитоза. ИЗФ меньше 1, 0 свидетельствует о сниженной киллерной функции нейтрофилов.
ИЗФ – среднее число поглощенных микроорганизмов через 30 мин/ среднее число поглощенных микроорганизмов через 120 мин.
Определение титра лизоцима в слюне
Лизоцим представляет собой термостабильный белок типа муколитического фермента. Он содержится в тканевых жидкостях животных и человека –в слезах, слюне, перитонеальной жидкости, плазме, сыворотке крови, лейкоцитах, материнском молоке и др.
Лизоцим продуцируется моноцитами крови и тканевыми макрофагами. Он вызывает лизис бактерий, но не активен в отношении вирусов.
Для определения титра готовят ряд последовательных разведений слюны в пробирках, в каждую из которых вносят по 1 мл. суспензии суточной культуры Micrococcuslisodecticus, содержащей 1 млрд/мл микробных тел.
(табл)