Тема: Методы микробиологической диагностики холеры
Цель: Изучить методы лабораторной диагностики холеры
Модуль 2: Специальная, клиническая и экологическая микробиология
Содержательный модуль 10. Патогеные прокариоты и эукариоты
Тема практического занятия 29: Методы микробиологической диагностики холеры.
Актуальнсть темы: Возбудителями холеры – острого инфекционного заболевания с тенденцией к широкому распространению, характеризующегося симптомами тяжелого гастроэнтерита с резким обезвоживанием и тяжелой интоксикацией, являются два биовара Vibrio cholerae: биовар cholerae и биовар eltor. В начале 1993 года вспышка холеры в юго-восточной Азии была вызвана вибрионами неизвестной серогруппы, обозначенных как серовар О139 (Бенгал).
Вид V.cholerae имеет 4 биовара: cholerae, eltor, proteus (в. Мечникова), albensis (светящийся вибрион). Холеру у человека вызывают биовары cholerae и eltor. Вибрион Мечникова вызывает гастроэнтерит. V.cholerae albensis обнаруживается в воде, испражнениях и желчи человека.
Морфология: Холерные вибрионы имеют вид подвижных изогнутых или прямых палочек. Подвижность обусловлена полярным жгутиком. Грамотрицательны, спор и капсул не образуют.
Культуральные свойства: Аероб, хорошо растет при tº-37ºС на простых питательных средах, но требователен к рН среды, растет на щелочных средах (8,5-9,0). На 1% пептонной воде образует легкое помутнение среды и пленку, на щелочном агаре - прозрачные колонии с ровным краем. Микроб не требователен к питательным средам, растет быстро: на 1% пептонной воде рост в виде пленки появляется через 4-6 часов.
Биохимические свойства: Холерные вибрионы активны в биохимическом отношении. Ферментация маннозы, сахарозы и арабинозы (триада Хейберга) имеет диагностическое значение; холерные вибрионы V.cholerae и V.eltor разлагают только маннозу и сахарозу и не расщепляют арабинозы. На основании биохимических и биологических различий холерные вибрионы разделяют на 2 биовара: классический (V.cholerae asiaticae) и Эль-Тор (V.cholerae eltor).
Антигенная структура. У холерных вибрионов выделяют термостабильные О- и термолабильные Н-антигены. По О-антигену вибрионы разделяются на несколько групп. Возбудители классической холеры и холеры Эль-Тор объединяются в 01 серогруппу, и несмотря на существующие биохимические различия, при исследовании на холеру обязательно проводят типирование О1 антисывороткой. О-антиген О1 группы холерных вибрионов неоднороден, включает три компонента –А,В,С, разные сочетания которых образуют серовары: Огава, Инаба, Гикошима.
Дифференциальные признаки возбудителей холеры
| № п/п | Признак | V.cholerae asiaticae | V.cholerae eltor |
| 1. | Рост на среде с полимиксином В | - | + |
| 2. | Гемолиз эритроцитов барана | - | + |
| 3. | Агглютинация куриных эритроцитов | - | + |
| 4. | Чувствительность к классическому монофагу С-4 по Мукерджи | + | - |
| 5. | Чувствительность к монофагу Эль-Тор | - | + |
Токсигенность и патогенность. Холерный вибрион обладает двумя типами токсинов – эндотоксином и экзотоксином или энтеротоксином. Эндотоксин- термостабильный, ЛПС (липополисахарид) клеточной стенки, индуцирует синтез виброцидных АТ. Основная роль в развитии симптомов холеры (энтерит с обильным водянистым стулом и последующим развитием обезвоживания организма) принадлежит энтеротоксину или холерогену. Энтеротоксин – термостабильный белок, резистентен к действию протеолитических ферментов. Состоит из двух белковых компонентов – А и В, компонент В практически нетоксичен, обладает способностью соединяться со специфическим рецептором мембраны эпителиальных клеток тонкого кишечника. Рецептором, связывающим компонент В, является ганглиозид. Компонент А – токсичен, вызывает активацию аденилатциклазы, что ведет к увеличению цАМФ (циклический АМФ) и соответственно к гиперсекреции солей и выходу из клеток воды, т.е. к возникновению одного из характерных симптомов холеры.
Единственный природный резервуар – больные и бактерионосители; основной путь передачи – фекально-оральный, реже - контактный. Факторы передачи – пищевые продукты, вода. Определенную роль играют мухи, способные переносить возбудитель с испражнений на пищевые продукты.
Патогенез. Попав в организм человека, большая часть вибрионов погибает под действием кислой среды желудка. Лишь небольшая часть их достигает тонкой кишки. В ответ на проникновение бактерий эпителиальные клетки выделяют щелочной секрет, насыщенный желчью – идеальная среда для размножения возбудителя.
Клинические проявления холеры обуславливает токсинообразование. Основная роль принадлежит энтеротоксину который активизирует аденилатциклазу слизистой кишечника, что способствует увеличению количества цАМФ и выходу солей и воды в просвет кишечника. В зависимости от степени интоксикации, симптоматика может иметь характер гастроэнтерита. В тяжелых случаях, у больных развивается холерный алгид на фоне нарушения электролитного баланса.
Материал для исследования. Испражнения, рвотные массы, желчь, секционный материал (фрагменты тонкой кишки), сточные воды, вода, пищевые продукты, мухи.
Лабораторная диагностика. Основу составляют выделения и идентификация возбудителя. Но так как холера особо-опасная инфекция, то первоначально из испражнений готовят мазки. Одни мазки красят по Грамму, другие обрабатывают специфической люминисцентной сывороткой для РИФ. На этом этапе исследования получают первичный ориентировочный ответ. РИФ применяют для ускоренной (экспресс) диагностики. Для проведения бактериологического исследования материал рекомендуется засевать одновременно на 1% пептонную воду и на щелочной агар. Через 12-24 часа отбирают круглые прозрачные с ровными краями, голубоватые в проходящем свете колонии, пересевают на лактозо-сахарную среду, ставят РА с О1 холерной сывороткой. Одновременно проводят дифференциацию от других вибрионов по биохимическим свойствам. Для эпидемиологического
исследования у культур определяют ее фаговар с набором специфических фагов.
Профилактика. Для специфической иммунопрофилактики были предложены различные вакцины, в том числе из убитых штаммов Инаба и Огава, холероген-анатоксин для подкожного применения и энтеральная химическая бивалентная вакцина, состоящая из анатоксина и соматических антигенов серотипов Инаба и Огава. Продолжительность поствакцинального иммунитета составляет не более 6-8 мес., поэтому прививки проводят только по эпидемиологическим показаниям. В очагах холеры проводится антибиотикопрофилактика тетрациклином.
Конкретные цели:
1. Изучить морфологию, культуральные и биохимические свойства холерного вибриона.
2. Знать холерные вибрионы патогенные для человека.
3. Изучить патогенез, клинику холеры.
4. Знать какой материал необходимо забирать от больного холерой для исследования.
5. Изучить методы лабораторной диагностики холеры.
6. Знать биологические препараты для диагностики профилактики и лечения холеры.
Уметь:
1. Готовить мазки из культуры холерного вибриона, красить по Граму, описывать его морфологию.
2. Дифференцировать патогенные вибрионы от непатогенних по антигенной структуре и биохимическим свойствам.
3. Дифференцировать биовары классического вибриона и вибриона Эль-Тор.
4. Делать забор материала от больного холерой.
5. Проводить экспресс-диагностику и выделять чистую культуру вибриона.
6. Трактовать результаты лабораторных исследований.
Теоретические вопросы:
1. Характеристика рода Vibrio: морфология, патогенные представители.
2. Культуральные особенности вибрионов.
3. Биохимические особенности вибрионов. Дифференциация патогенных и непатогенных вибрионов.
4. Антигенная структура. Классификация вибрионов по антигенной структуре.
5. Токсинообразование. Патогенность. Механизм действия экзотоксина.
6. Источник инфекции. Пути заражения холерой. Патогенез. Материал для исследования.
7. Лабораторная диагностика холеры. Экспресс-диагностика, выделение чистой культуры.
8. Специфическая профилактика холеры.
9. Лечение холеры.