Глава 1. Взаимодействие с биологическими мембранами и модельными бислоями

Институт биологии и биомедицины

Кафедра молекулярной биологии и биомедицины

РЕФЕРАТ

Биохимическое значение резорцинольных липидов в проявлениях жизнедеятельности прокариот и эукариот

Выполнил:
Экстерн

Шаров Михаил Андреевич
03.01.04 «Биохимия»

Н.Новгород
2016

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

Фенольные липиды являются вторичными метаболитами (несущественные для клеточного роста), синтезируемыми главным образом растениями (из растений), а также животными, грибами и бактериями как во время нормального развития, так и в ответ на стрессовые условия, такие как инфекции, ранения и УФ-излучение. Эти соединения являются очень разнообразной группой и включают два простых однокольцевых фенола и их производные. Химически производные, называемые фенольными липидами, являются производными моно- и дигидрофенолы, а именно катехол, резорцин, гидрохинон. Междисциплинарный интерес к фенольным липидам, от чистой и промышленной химии до сельскохозяйственных, пищевых и биомедицинских наук, привел к увеличению количества исследовательских групп для изучения различных сторон активности фенольных липидов. В течение последних нескольких лет было несколько интересных и всесторонних обзоров о фенольных липидах, особенно резорциновых липидах, которые, оказывается, являются наиболее исследованными компонентами этой группы. Все началось с обзора Козубека и Тимана, которые предоставили полное описание известных тогда возникновения (распространения), изоляции, анализа (исследования) и метода структурного определения, а также синтеза и биологической активности резорциновых липидов. За этим последовали обзоры о методах выделения, хроматографическом анализе и метаболизме алкилрезорцинов, статьи о некоторых свойствах соединений в муке из цельнозерновых культур, включая резорциновые липиды, и обзоры о вторичных метаболитах растений и их анализе и применении. Коррейя с соавторами описали наличие, распределение и биологические активности различных фенольных липидов семейства Анакардиевые, или Сума́ховые. Номенклатура, возникновение (распространение), химические структуры, биосинтез и химический синтез, изоляция и отделение, а также химические и биологические свойства анакардовых кислот были представлены Тиманом, тогда как Луби и Тахиль описали несколько промышленных областей применения фенольных липидов от Анакардиевых.

M. Стасюк и A. Козубек опубликовали обзорную статью по фенольным липидам и алкилоксибензолам в частности, в которой описали биологические и биохимические свойства данных соединений.

Алкилоксибензолы (АОБ) составляют широкую группу молекул микробного и растительного происхождения. Универсальные механизмы их биологической активности заключаются в установлении гидрофобных, электростатических и водородных взаимодействий с широким кругом биополимеров, результатом чего является модификация структурной организации и функциональной активности последних. При этом формирование подобных эффектов оказывается возможным и в гетерологичных системах, в частности – в отношении ферментных и рецепторных белков животного происхождения. Другой интересной особенностью АОБ является их способность модифицировать свойства полимерных субстратов.

Глава 1. Взаимодействие с биологическими мембранами и модельными бислоями

Многие важные процессы клеточного обмена веществ связаны с биологическими мембранными структурами и зависят от их свойств. Структура и динамика липидных бислоев являются решающими для их биологической функции. Включение чужеродных соединений, например, других липидов или препаратов в двухслойную систему изменяет структуру бислоя и его биологическую функцию. Фенольные липиды обладают очень заметными амфифильными свойствами и могут включаться в фосфолипидный бислой. Этот процесс очень часто вызывает изменения в биологической мембране, а также модельных бислоях.

Батраков и соавторы, используя бактериальные алкилрезорцины, показали, что гомологи с насыщенными цепями могут образовывать устойчивые черные липидные мембраны, особенно при высоких рН >7,5. В щелочных условиях кардол и метилкардол из жидкости оболочки кешью образуют липосомальные структуры поодиночке, а также в смесях с холестерином, жирными кислотами или фосфатидилэтаноламином. Эти везикулярные структуры показывают относительно высокий захват молекул-маркеров и стабильность размеров. Сохранение захваченного вещества зависит от типа резорцинольных липидов и температуры, но это в целом ниже, чем у контрольных фосфолипидных липосом.

Гексилрезорцин является химическим аналогом микробных аутоиндукторов анабиоза группы алкилоксибензолов. Исследование электронной микроскопией липосомальных суспензий предоставило доказательства увеличения размера липосом и их агрегации в ответ на введение гексилрезорцина при надкритических концентрациях (2.0–4.75× 10^-4M). Гексилрезорцин в надкритических концентрациях (5,0×10^-4М и выше) вызывал разрушение липосом.

Все большее количество резорцинольных липидов в липосомальных мембранах, изготовленных из фосфатидилхолина, вызывало удивительное изменение в термотропных свойствах фосфолипидных бислоев. Насыщенные и ненасыщенные гомологи этих соединений при низких концентрациях в мембране показали хорошую смешиваемость с фосфолипидами. Также было отмечено, что с увеличением концентрации алкил(ен)резорцинов в бислоях наблюдались эффекты, связанные с фазовым расслоением, и сдвиг основного фазового перехода в сторону более высоких температур. При низких концентрациях в мембране (5-20 моль%) насыщенные и мононенасыщенные С17-гомологи показали различное влияние на термотропные свойства гидратированного дипальмитоилфосфатидилхолина. При концентрациях >10 мол% насыщенный гомолог вызывал переход L_β→P_β, повышение температуры и энтальпии основного фазового перехода. Ненасыщенный гомолог вызывал сдвиг перехода к более высокой температуре, с расширением основного перехода, но снижение его энтальпии. При концентрации в мембране выше 15 мол% алкил(ен)резорцина процесс разделения фаз наблюдался в смесях фосфатидилхолина и резорцинольных липидов.

Фенольные липиды могут вызвать значительные изменения в биофизических свойствах фосфолипидного бислоя. Одним из них является нарушение упаковки молекул компонентов бислоя. Наличие включенных резорцинольных липидов в бислое лецитиновых везикул влияет на текучесть мембраны, измеренной по подвижности спин-меченых жирных кислот. При температуре выше температуры фосфолипидного фазового перехода насыщенные и ненасыщенные гомологи в концентрации <6 мол% вызывали увеличение в параметре упорядочения для 5-доксистеарата. В высоких концентрациях в липидной мембране (6-14 мол%) изучаемые гомологи также значительно уменьшали подвижность 12-доксистеарата. Резорцинольные липиды показали наиболее сильное влияние на подвижность обоих типов маркеров (подвижности 5-доксистеарата и 12-доксистеарата) в липосомальных мембранах, включающих холестерин. Это холестериноподобное действие резорцинольных липидов показано при низких концентрациях мембранного алкил(ен)резорцина и было сильнее для мембран, содержащих высокие концентрации холестерина. Похожий стабилизирующий эффект алкилрезорцинов наблюдался в бислое дифосфатидилглицерина с пиреном как флуоресцентным маркером.

Влияние 5-н-алкилрезорцинов на свойства фосфолипидных везикул зависит от асимметрии их локализации. Значительное увеличение двухслойной проницаемости наблюдалось, когда названные соединения присутствовали только во внешней среде. Когда эти амфифилы были предварительно включены в лецитиновый бислой во время его формирования, полученные липосомы эффективно инкапсулировали водорастворимые растворы, их размер был меньше, чем у липосом чистого лецитина и они были более однородными и стабильными. Гексилрезорцин влияет на стабильность моноламеллярных липосом, сформированных из яичного фосфатидилхолина. Было установлено, что критическое отношение между гексилрезорцином и яичным лецитином для защиты липосом против литической активности поверхностно-активного вещества Tween 20 близко к эквимолярному. Двойной эффект «стабилизация/дестабилизация» резорцинольных липидов был исследован с помощью моделирования атомно-молекулярной динамики для выяснения его молекулярной природы. Исследования взаимодействий любого из трех резорцинольных гомологов, отличающихся длиной алкильного хвоста, с липидным бислоем из димиристоилфосфатидилхолина показали, что резорцины, предварительно включенные в бислои, вызывают упорядоченность внутри липидных ацильных цепей, снижают гидратацию липидных полярных головных групп и делают бислои менее проницаемыми для молекул воды. Моделирование, при котором резорцины были соединены с водным раствором в предварительно сформированном фосфолипидном бислое, выявляло его локальное разрушение, ведущее либо к образованию временных пор, либо даже полной дезинтеграции бислоя.

Резорцинольные липиды, добавленные во внешнюю среду, вызывали утечку ионов калия из эритроцитов и увеличивали проницаемость мембран эритроцитов для неэлектролитов с молекулярным диаметром до 1,4 нм. Они также индуцировали высокую проницаемость мембран для воды. Повышенная проницаемость мембраны часто приводит к клеточному гемолизу. Было показано, что существует взаимосвязь между гемолитической активностью резорцинольных липидных гомологов и длиной и степенью ненасыщенности алифатической боковой цепи. Фенольные и резорцинольные липиды, выделенные из жидкости оболочки кешью, демонстрируют более высокую способность к гемолизу эритроцитов, чем алкил(ен)резорцины из ржаных отрубей. Влияние фенольных липидов и их производных на барьерные функции биологических мембран модулируется присутствием двухвалентных катионов, которые защищают эритроциты от литического действия резорцинольных, а также фенольных липидов. Степень защиты эритроцитов зависит от типа катиона и типа резорцинольных липидов, хотя было обнаружено, что ионы Zn²⁺ являются самыми активными в противогемолитической защите.

Исследования до настоящего времени показали, что все исследованные фенольные и резорцинольные липиды в сублитической концентрации защищают эритроциты от лизиса в гипоосмотических условиях. Самая низкая защита была показана у анакардиевой кислоты и резорцинольных липидов из ржаных отрубей. Наиболее эффективным противолитическим агентом являлся кардол в концентрации 5 мкМ, который подавляет более чем 50% лизиса.

Гидрокси- или дигидроксибензольное кольцо в молекуле фенольных липидов предполагает возможность замены этих соединений, таких как убихинон или пластохинон, в посреднических процессах электронного и протонного транспорта. Длинноцепочечные резорцинольные липиды (C10, C19) в концентрации 10^-4 М ингибируют дыхание клеток дрожжей, Bacillus cereus, Micrococcus lysodeicticus и тимоцитов. Длинноцепочечные алкилрезорцины также ингибируют окисление НАД-зависимых субстратов в изолированных митохондриях.

С использованием гидрофобизованных производных широкопористого криогеля поливинилового спирта с различным содержанием привитых изобутильных группировок показано, что гидрофобные свойства поверхности клеток сильнее выражены у грамотрицательных бактерий. Гидрофобность клеточной поверхности при обработке бактерий ауторегулятором гексилрезорцином усиливается у грамотрицательных и снижается у грамположительных. Получены данные, свидетельствующие о вариабельности гидрофобных свойств поверхности грамположительных бактерий (Bacillus subtilis и Staphylococcus epidermidis).

Поверхность грамотрицательных бактерий становится более гидрофобизованной по сравнению с поверхностью необработанных клеток вследствие усиления гексилрезорцином гидрофобных свойств внешней липидной мембраны. Грамположительные бактерии отчасти теряют гидрофобность. Вероятно, связывание гексилрезорцина с липопротеидами и липополисахаридами клеточной стенки приводит к их модификации поверхностных структур.

Таким образом, благодаря амфифильным свойствам фенольных липидов, значительная часть их эффекта (влияния) связана с их взаимодействием с мембранными структурами и гидрофобными доменами белков.