Хроматографический метод анализа

В широком смысле слова хроматография - это разделение двух- и многокомпонентных смесей газов, паров жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в динамических условиях: Обычно разделение происходит при прохождении потока смеси через колонку, содержащую слой зерненого сорбента. При этом даже близкие по составу или строению вещества различно поглощаются сорбентами, происходит избирательная адсорбция, сильно сорбирующиеся вещества поглощаются в верхней части колонки, а слабее сорбирующиеся продвигаются дальше. Достигается разделение смеси на отдельные компоненты по длине колонки при повторяющихся процессах сорбции и десорбции в элементарных слоях. Хроматографические разделения используются для качественного и количественного анализа.

 

Хроматография — современный и высокоэффективный метод, позволяет достаточно быстро и надежно определять содержание отдельных компонентов в смесях, концентрировать и идентифицировать эти компоненты. Она эффективна не только в химическом анализе, но и в химической технологии.

 

В биологии и агропромышленной сфере хроматографическое разделение и концентрирование используют перед количественным определением микроэлементов, а также для обнаружения пестицидных соединений в окружающей среде. При технологическом контроле пищевых производств хроматография служит для очистки веществ, анализа смесей органических кислот, аминокислот и других продуктов.

 

 

3. Классификация методов хроматографии

 

Хроматографические методы классифицируют по агрегатному состоянию среды, в которой осуществляется разделение смеси на компоненты; механизму (или химизму) процесса разделения; форме (аппаратуре или технике) проведения хроматографического процесса.

 

По агрегатному состоянию среды для разделения смеси различают газовую, жидкостную и газожидкостную хроматографию.

 

По механизму разделения смесей выделяют адсорбционную, ионообменную распределительную, осадочную, лигандообменную хроматографию. Иногда выделяют окислительно-восстановительную, адсорбционно-комплексообразовательную хроматографию и др.

 

Различают колоночную, капиллярную и плоскостную хроматографии, т. е. хроматографию на бумаге (бумажную) и хроматографию в тонком слое (тонкослойную).

 

Особо стоят ионная и высокоэффективная жидкостная хроматография. В некоторых вариантах разделение смесей веществ происходит в результате наложения нескольких механизмов, действующих одновременно. При этом образуются хроматограммы смешанного типа, но один из механизме всегда остается преобладающим.

 

По способу получения хроматограмм в хроматографическом методе различают фронтальный, вытеснительный и элюентный анализы. При фронтальном анализе исследуемую смесь непрерывно подают в верхнюю часть колонки сорбента. Если раствор двухкомпонентный, т.е.

 

содержит вещества А и В, то первым из колонки вытекает чистый растворитель, а после насыщения сорбента менее сорбирующимся веществом В, вытекает раствор, содержащий только компонент В. Но когда сорбент насытится веществом А, в приемник начинают поступать и компонент А и компонент В, т.е. оба компонента исходного раствора. Таким образом, при фронтальном анализе удается получить в чистом виде только одно, наименее сорбирующееся вещество двухкомпонентной (или многокомпонентной) смеси, полного разделения смеси на отдельные компоненты не происходит.

 

При вытеснительном анализе в колонку вводят порцию раствора, содержащего вещества А и В, которые поглощаются сорбентом. Затем эти компоненты вытесняются более сорбирующимся веществом О, т. е, компоненты вытесняются в соответствии с их избирательной сорбируемостью. Вследствие этого, компоненты А и В перемещаются вдоль слоя сорбента со скоростью, равной скорости движения вытесняющего вещества В. Сначала из колонки вытекает фракция, содержащая менее сорбируемый компонент В, а затем — компонент А, следовательно, при вытеснительном анализе получают в чистом виде веществ* двухкомпонентной (или многокомпонентной) смеси.

 

При элюентном анализе в колонку вводят порцию исследуемого раствора содержащего несколько компонентов (А, В, С) и непрерывный поток растворителя. В полученной хроматограмме положение компоненте соответствует их сорбируемости, например А> В > С, т.е. нижняя зон; хроматограммы содержит чистое вещество С. Затем колонну промывают чистым растворителем и компоненты смеси перемещаются вдоль нее вытесняя друг друга. Франции фильтрата содержат сначала компонент С затем В и, наконец, компонент А.

 

Массу каждого компонента, выделенного из смеси тем или иным хроматографическим методом, определяют обычными химическими, физико-химическими или физическими методами.

 

 

4. Краткие сведения о хроматографических методах анализа

 

В аналитической практике широко применяют хроматографические методы анализа.

 

Впервые хроматографический метод анализа был предложен 1903г. русским ученым М. С. Цветом.

 

Сущность хроматографического метода анализа заключается в следующем. Раствор смеси веществ, подлежащих разделению, пропускают через стеклянную трубку, наполненную твердым адсорбентом. Адсорбентами называют твердые тела, на поверхности которых происходит поглощение (адсорбция) отдельных компонентов анализируемой смеси. Стеклянную трубку, заполненную адсорбентом, называют адсорбционной колонкой.

 

Вследствие различной адсорбируемости и скорости передвижения отдельных веществ, находящихся в анализируемом растворе, компоненты смеси удерживаются на различной высоте столба адсорбента в виде отдельных зон (слоев). Вещества, обладающие большей способностью адсорбироваться, поглощаются в верхней части адсорбционной колонии, хуже адсорбируемые - располагаются ниже. Вещества, не способные адсорбироваться данным адсорбентом, проходят через колонну, не задерживаясь, и собираются в фильтрате.

 

 

5. Виды хроматографического метода анализ.

 

По механизму разделения различают следующие, виды хроматографического метода анализа: адсорбционную, распределительную, ионообменную, осадочную, окислительно-восстановительную и адсорбционно-комплексообразовательную хроматографию.

 

Адсорбционная хроматография основана на избирательной адсорбции (поглощении) отдельных компонентов анализируемой смеси соответствующими адсорбентами. При работе этим методом анализируемый раствор пропускают через колонку, заполненную мелкими зернами адсорбента.

 

На характере получаемых хроматограмм сильно сказываются природа и структура адсорбента, свойства растворителя, состав и строение анализируемого вещества, скорость движения раствора, температура и т. п. Применяют адсорбционную хроматографию преимущественно для разделения неэлектролитов, паров и газов.

 

Распределительная хроматография основана на использовании различия коэффициентов распределения, отдельных компонентов анализируемой смеси между двумя несмешивающимися жидкостями. Одна из жидкостей (неподвижная) распределена на пористом веществе (носитель), а вторая (подвижная) представляет собой растворитель, не смешивающийся с первым. Этот растворитель пропускают через колонку с небольшой скоростью.

 

Различные значения коэффициентов распределения обеспечивают неодинаковую скорость движения, и разделения компонентов смеси.

 

Коэффициентом распределения вещества между двумя несмешивающимися растворителями называют отношение концентрации вещества в одном (в нашем случае подвижном) растворителе к концентрации того же вещества в другом (неподвижном) растворителе.

 

В распределительной хроматографии одним из растворителей обычно служит вода. Она является неподвижным растворителем и находится в порах носителя, например крахмала или силикагеля. Разделение при помощи распределительной хроматографии выполняют следующим путем. Анализируемую смесь веществ, растворенную в воде, вводят в колонку и, после того как раствор впитается верхней частью носителя, промывают колонку подвижным растворителем (например, бутиловым спиртом или смесью растворителей). В процессе промывания происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкостями (вода - растворитель). Поскольку разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, то и скорость передвижения отдельных компонентов тоже различна. Наибольшей скоростью движения обладает то вещество, которое имеет наибольший коэффициент распределения. При промывании колонки образуются отдельные зоны чистых веществ.

Хроматогра́фия (от др.-греч. χρῶμα — «цвет») — метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Основан на распределении веществ между двумя фазами — неподвижной (твёрдая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе) и подвижной (газовая или жидкая фаза, элюент). Название метода связано с первыми экспериментами по хроматографии, в ходе которых разработчик метода Михаил Цвет разделял ярко окрашенные растительные пигменты.

История метода[править | править код]

Метод хроматографии был впервые применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция, для разделения пигментов растительного происхождения. Первое сообщение о разработке метода хроматографии было сделано Цветом 30 декабря 1901 года на XI Съезде естествоиспытателей и врачей в С.-Петербурге. Первая печатная работа по хроматографии была опубликована в 1903 году, в журнале «Труды Варшавского общества естествоиспытателей». Впервые термин «хроматография» появился в двух печатных работах Цвета в 1906 году, опубликованных в немецком журнале Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. В 1907 году Цвет демонстрирует свой метод Немецкому Ботаническому обществу.

В 1910—1930 годы метод был незаслуженно забыт и практически не развивался.

В 1931 году Р. Кун, А. Винтерштейн и Е. Ледерер при помощи хроматографии выделили из сырого каротина α и β фракции в кристаллическом виде, чем продемонстрировали препаративную ценность метода.

В 1941 году А. Дж. П. Мартин и Р. Л. М. Синг разработали новую разновидность хроматографии, в основу которой легло различие в коэффициентах распределения разделяемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями. Метод получил название «распределительная хроматография».

В 1944 году А. Дж. П. Мартин и Р. Л. М. Синг предложили метод бумажной хроматографии, заменив хроматографическую колонку на фильтровальную бумагу.^[1]

В 1947 году Т. Б. Гапон, Е. Н. Гапон и Ф. М. Шемякин разработали метод «ионообменной хроматографии».

В 1952 году Дж. Мартину и Р. Сингу была присуждена Нобелевская премия в области химии за создание метода распределительной хроматографии.

С середины XX века и до наших дней хроматография интенсивно развивалась и стала одним из наиболее широко применяемых аналитических методов.

Терминология[править | править код]

Основные термины и понятия, относящиеся к хроматографии, а также области их применения были систематизированы и унифицированы специальной комиссией ИЮПАК^[2]. Согласно рекомендациям ИЮПАК, термин «хроматография» имеет три значения и используется для обозначения специального раздела химической науки, процесса, а также метода.

• Хроматография — наука о межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешивающихся и движущихся друг относительно друга фаз.
• Хроматография — процесс дифференцированного многократного перераспределения веществ или частиц между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами, приводящий к обособлению концентрационных зон индивидуальных компонентов исходных смесей этих веществ или частиц.
• Хроматография — метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различиях в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.
• Колонка — содержит хроматографический сорбент, выполняет функцию разделения смеси на индивидуальные компоненты.
• Элюент — подвижная фаза (растворитель или смесь растворителей): газ, жидкость или (реже) сверхкритический флюид.
• Неподвижная фаза — твёрдая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе, в адсорбционной хроматографии — сорбент.
• Хроматограмма — результат регистрирования зависимости концентрации компонентов на выходе из колонки от времени.
• Детектор — устройство для регистрации концентрации компонентов смеси на выходе из колонки.
• Хроматограф — прибор для проведения хроматографии.

Существуют различные способы классификации хроматографических методов.

По физической природе неподвижной и подвижной фаз [править | править код]

1. Жидкостная хроматография (если подвижная фаза жидкая).

Жидкостную хроматографию, в свою очередь, можно разделить в зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы на твёрдо-жидкофазную (ТЖХ) — неподвижная фаза твёрдая и жидко-жидкофазную хроматографию (ЖЖХ) — неподвижная фаза жидкая. ЖЖХ часто называют распределительной хроматографией.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) один из эффективных методов анализа и разделения сложных смесей. Принцип хроматографического разделения также лежит в основе ряда технологических процессов. Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна. Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (до 1.8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 минут).

1. Газовая хроматография (если подвижная фаза газообразная).

Газовую хроматографию в зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы делят на газоадсорбционную (ГТХ, ГАХ) и газожидкостную (ГЖХ) или газораспределительную.

В зависимости от способа перемещения сорбатов вдоль слоя сорбента [править | править код]

1. Проявительный (элюентный) — при его использовании пробу исследуемой смеси вводят порцией в начальной точке (на входе в колонку) в разделительную насадку (сорбент). Под действием потока подвижной фазы зона пробы перемещается вдоль колонки, причём скорости перемещения отдельных компонентов пробы обратно пропорциональны величинам соответствующих им констант распределения.
2. Фронтальный — при этом разделяемая смесь непрерывно поступает на слой сорбента в начальной точке и, таким образом, фактически играет роль подвижной фазы.
3. Вытеснительный — методика проведения разделения вытеснительным методом аналогична методике проведения разделения проявительным методом, но без использования несорбирующегося элюента (подвижной фазы). Перемещение хроматографических зон достигается путём вытеснения компонентов разделяемой смеси веществом, которое сорбирует сильнее любого из этих компонентов. Каждый компонент этой пробы вытесняет компоненты, которые взаимодействуют с неподвижной фазой менее сильно, чем он сам.
4. Электрохроматография — хроматографический процесс, при котором движение заряженных частиц осуществляется под действием приложенного электрического поля. Скорость движения частиц определяется их массой и зарядом.

Для аналитических целей наиболее широко используется элюентный (проявительный) метод хроматографирования.

В зависимости от природы процесса, обусловливающего распределение сорбатов между подвижной и неподвижной фазами [править | править код]

1. Адсорбционная хроматография — разделение за счёт адсорбции основано на различии адсорбируемости компонентов смеси на данном адсорбенте.
2. Распределительная хроматография — разделение основано на различии в растворимости сорбатов в подвижной и неподвижной фазах или на различии в стабильности образующихся комплексов.
3. Ионообменная хроматография — разделение основано на различии констант ионообменного равновесия.
4. Осадочная хроматография — разделение основано на различной растворимости осадков в подвижной фазе.
5. Аффинная хроматография — основана на биоспецифическом взаимодействии компонентов с аффинным лигандом;
6. Эксклюзионная хроматография — разделение основано на различии и проницаемости молекул разделяемых веществ в неподвижную фазу. Компоненты элюируются в порядке уменьшения их молекулярной массы.

В зависимости от механизма сорбции [править | править код]

Хроматография подразделяется на молекулярную, ситовую, хемосорбционную и ионообменную. В молекулярной хроматографии природой сил взаимодействия между неподвижной фазой (сорбентом) и компонентами разделяемой смеси являются межмолекулярные силы типа сил Ван-дер-Ваальса.

К хемосорбционной хроматографии относят осадочную, комплексообразовательную (или лигандообменную), окислительно-восстановительную. Причиной сорбции в хемосорбционной хроматографии являются соответствующие химические реакции.

По технике выполнения (характеру процесса) [править | править код]

Разделяют хроматографию на:

1. колоночную (неподвижная фаза находится в колонке);
2. плоскостную (планарную) — бумажную и тонкослойную (неподвижная фаза — лист бумаги или тонкий слой сорбента на стеклянной или металлической пластинке);
3. капиллярную (разделение происходит в плёнке жидкости или слое сорбента, размещённом на внутренней стенке трубки);
4. хроматографию в полях (электрических, магнитных, центробежных и других сил).

В зависимости от цели проведения хроматографического процесса [править | править код]

Различают аналитическую, неаналитическую, препаративную и промышленную хроматографию. Аналитическая хроматография предназначена для определения качественного и количественного состава исследуемой смеси.

По агрегатному состоянию фаз [править | править код]

• Газовая хроматография
• Газо-жидкостная хроматография
• Газо-твёрдофазная хроматография
• Жидкостная хроматография
• Жидкостно-жидкостная хроматография
• Жидкостно-твёрдофазная хроматография
• Жидкостно-гелевая хроматография
• Сверхкритическая флюидная хроматография

По рабочему давлению [править | править код]

• Хроматография низкого давления (FPLC)
• Хроматография высокого давления (HPLC)
• Хроматография ультравысокого давления (UHPLC)

По механизму взаимодействия [править | править код]

• Распределительная хроматография
• Ионообменная хроматография
• Адсорбционная хроматография
• Эксклюзионная хроматография
• Аффинная хроматография
• Осадочная хроматография
• Адсорбционно-комплексообразовательная хроматография

По цели проведения [править | править код]

• Аналитическая хроматография
• Полупрепаративная хроматография
• Препаративная хроматография
• Промышленная хроматография

По способу ввода пробы [править | править код]

• Элюентная хроматография (проявительная, редк. элютивная)

Наиболее часто используемый вариант проведения аналитической хроматографии. Анализируемую смесь вводят в поток элюента в виде импульса. В колонке смесь разделяется на отдельные компоненты, между которыми находятся зоны подвижной фазы.

• Фронтальная хроматография^[4]

Смесь непрерывно подают в колонку, при этом на выходе из колонки только первый, наименее удерживаемый компонент можно выделить в чистом виде. Остальные зоны содержат 2 и более компонентов. Родственный метод — твердофазная экстракция (сорбционное концентрирование).

• Вытеснительная хроматография

В колонку после подачи разделяемой смеси вводят специальное вещество-вытеснитель, которое удерживается сильнее любого из компонентов смеси. Образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых веществ.

Отдельные виды хроматографии[править | править код]

• Высокоэффективная жидкостная хроматография
• Тонкослойная хроматография
• Газовая хроматография с программированием температуры
• Хроматермография
• Газовая хроматография с программированием расхода газ-носителя
• Газовая хроматография с программированием давления газ-носителя
• Хромабарография
• Хроматофокусирование

 

Рефрактометрический метод основан на определенной зависимости между показателем преломления раствора и концентрацией сахара в нем. Содержание в водном растворе можно определить с точностью 0,03%. Однако отсутствие в водной вытяжке других водорастворимых веществ искажает коэффициент преломления сахара. Поэтому данный метод используется в изделиях, где мало водорастворимых веществ, внося определенные поправки на коэффициент рефракции исследуемого раствора. Метод используют для определения сахарозы в кремах, бисквитах, сдобных хлебобулочных изделиях. Определение ведут с использованием рефрактометра РПЛ-2.

 

 

Контрольные вопросы:

 

1.Какие хроматографические параметры можно использовать для идентификации компонентов смеси?

2. Укажите возможности и ограничения разных количественных методов хроматографического анализа.

3. Что такое градиентное элюирование, какое оно дает преимущество?

4. Что такое программирование температуры, почему оно позволяет улучшать разделение?

 

Поляриметрический метод основан на способности растворов сахарозы вращать плоскость поляризованного луча. Используют два вида этого метода: инверсионную и непосредственную поляриметрию. При инверсионной поляриметрии сахарозу инвертируют кислотами, а затем измеряют удельное вращение плоскости поляризации инвертного сахара. По удельному вращению плоскости поляризации исследуемого раствора вычисляют содержание растворов.

 

При поляриметрии, оптическую активность cахаров, присутствующих в растворе наряду с сахарозой и мешающих определению последней, разрушают химическим путем. Например, оптическое вращение глюкозы и фруктозы подавляют добавлением натровых солей борной кислоты.

 

Поляриметрический метод используют для контроля качества молочных продуктов и кондитерских изделий. В молочных продуктах этим методом определяют лактозу и сахарозу. По содержанию лактозы в кипяченном молоке обнаруживают возможное его разбавление. Анализ проводят на приборе сахариметре СУ-3. Поляриметрическим методом можно определить сахарозу в твороге с сахаром, творожном фарше, простокваше, кефире с сахарной пудрой и т.д.

 

Колориметрические методы определения cахаров основаны на окислении редуцирующих cахаров и суммы всех cахаров определенными окислителями, в результате чего образуются окрашенные вещества или изменяется интенсивность окраски окислителя. По интенсивности окраски раствора находят концентрацию сахара в нем. Наибольшее распространение получил метод, позволяющий учитывать общее количество cахаров в растворе.

 

Для производственного контроля кондитерских изделий можно использовать бихроматный и феррицианидный методы.

 

Бихроматный метод используют для контроля изделий, в которых определяют общее количество сахара в пересчете на сахарозу (полуфабрикаты из теста, сдобные хлебобулочные изделия). Метод основан на окислении cахаров раствором двухромовокислого калия в серной кислоте. При этом изменяется окраска бихромата. По оптической плотности раствора окислителя после реакции с сахарами на калибровочной кривой находят концентрацию сахара.

 

Феррицианидный метод используют для определения cахаров и сахарозы в любых видах кондитерских изделий. Определение основано на окислении редуцирующих cахаров щелочным раствором железосинеродистого калия с последующим определением окраски окислителя на фотоэлектроколориметре.

 

МЕТОДЫОЦЕНКИ КОНДИЦИОННОСТИ ПРОДУКТА, ОБНАРУЖЕНИЕ ФАЛЬСИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ СВЕЖЕСТИ ПОЛУФАБРИКАТОВ С ПОМОЩЬЮ ЛЮМИНИСЦЕНТНОГО МЕТОДА.

 

Люминисценция - это такое возбуждение состояния атомов и молекул вещества, при котором оно (вещество) светится без выделения тепла. Из известных видов люминисценции для люминисцентного анализа используется так называемая флуоресценция - способность вещества светиться (флуорисцировать) при облучении его другим источником света, в качестве которого используют источники ультрафиолетового света. Флуоресценция возникает только в процессе облучения и после прекращения последнего исчезает. Облучаемое вещество излучает видимую часть спектра большей длины волны, чем возбуждающее излучение, т.е. согласно закона Стокса происходит преобразование длин волн (из невидимого свет становится видимым).

 

Каждому веществу, в зависимости от его состава и состояния, присущи определенная интенсивность и характерный цвет, пользуясь которыми можно судить о его качестве. Наблюдения за свечением вещества при визуальном люминисцентном анализе необходимо вести в темноте, т.к. слабое свечение в других условиях воспринять глазом затруднительно. В настоящее время уже имеется возможность определения интенсивности свечения с помощью фотоэлектрических приборов.

 

1. Определения кондиционности сосисок и сарделек основано на различном свечении сырья (говядины и свинины), используемого для приготовления этих видов колбасной продукции. Для проведения анализа изделия разрезают вдоль и укладывают на стекло поверхностью вверх. Далее направляют поток УЛ на поверхность разреза и отмечают характер свечения, сравнивая его с данными разработанных таблиц:

 

В частности: Сардельки:

 

Свиных высшего сорта - характерно розовое свечение; Свиных первого сорта - розовато-коричневого.

 

2. Обнаружение замены сливочного масла маргарином в кондитерских кремах основано на различном свечении в ультрафиолетовом свете маргарина и сливочного масла. Сливочное масло имеет желтое свечение разного оттенка: от яркого до бледного с зеленоватыми тонами. Желтое свечение обусловлено рибофлавином, поэтому, чем интенсивнее окрашено сливочное масло, тем сильнее его свечение. Молочный жир в чистом виде лишен сколько-нибудь интенсивной флуоресценции. Маргарин отличается голубовато-сиреневым свечением.

 

В три пробирки отвешивают соответственно 3г крема, сливочное масло и маргарин, имеющиеся на производстве, (пропорционально заложенным в крем) и добавляют по 10 мл эфира. Все пробирки одновременно освещают лампой для люминисцентной диагностики. Отличие в свечении крема от свечения сливочного масла свидетельствует о добавлении маргарина.

 

Определение доброкачественности мясных и рыбных полуфабрикатов люминисцентным методом основано на том, что мясо и рыба содержат в себе вещества со свойствами свечения (люминафоры), причем этих светящихся веществ в доброкачественных полуфабрикатах животного происхождения содержится меньше, чем в продуктах, подвергающихся разложению и обсемененных различными микроорганизмами.