и его роль в организме человека»




Выполнил: Овчаров П.С.

 

Москва 2013

Ещё в конце XVIII века врачами впервые был обнаружен эффект уменьшения вплоть до полного исчезновения раковых опухолей у людей, перенесших какое-либо инфекционное заболевание. Затем, в начале ХХ века доктором Вильямом Коли были предприняты попытки воспроизвести данное явление при помощи инъекций онкологическим пациентам живых или убитых как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Также предпринимались попытки вводить пациентам препараты, полученные путём фильтрования культур этих бактерий («Токсины Коли»). Хотя применение данной терапии не получило распространения в виду высокой токсичности вводимых препаратов, отдельные случаи успешного излечения положили начало фундаментальным исследованиям в этой области.

Приблизительно через полвека был выделен и очищен из грамотрицательных бактерий липополисахарид, эффективно индуцировавший некроз опухолей. Впоследствии исследователи пришли к выводу, что некроз опухолей обусловлен не самим липополисахаридом, а продукцией некоего фактора, который выделяется в ответ на взаимодействие с липополисахаридом. Сначала полагали, что ФНО продуцируют макрофаги, активируемые при стимуляции липополисахарида, но затем было доказано, что ФНО способны продуцировать не только макрофаги, но и NK-клетки (при соответствующей индукции), некоторые субпопуляции Т-лимфоцитов и даже ряд опухолевых клеточных линий.

Очистка белка до гомогенности была достигнута в 1984 году. На основе данных об аминокислотной последовательности ФНО человека и кролика, несколько групп клонировали кДНК гена ФНО человека. Позже были получены кДНК гена ФНО мыши, кролика и других организмов. ФНО мыши и человека были экспрессированы в клетках Е. coli и очищены. Тем самым, высокоочищенные рекомбинантные ФНО мыши и человека стали доступны для физико- химических и биохимических исследований, а также для применения в клинических целях. Вскоре после публикации последовательности гена ФНО человека и клонирования гена ФНО мыши был клонирован ген кахектина мыши, медиатора септического шока (осложнения инфекционного заболевания, вызванного бактериями, с большой вероятностью летального исхода). Неожиданностью оказалась идентичность нуклеотидных последовательностей кахектина и ФНО. Первоначальные надежды на скорое создание универсального противоопухолевого препарата осложнились высокой токсичностью ФНО/кахектина, не позволяющей системного применения препарата. Более того, было показано, что для ряда опухолей ФНО служит фактором, способствующим метастазированию.

Итак, что же представляет собой фактор некроза опухолей?

В настоящее время известно две разновидности фактора некроза опухолей: ФНО-α и ФНО-β. Это два сходных по структуре белка, которые проявляют сходную активность по отношению к воспалительной реакции, иммунным и опухолевым процессам. Основным источником ФНО-α является активированный макрофаг, а ФНО-β – активированный Т-лимфоцит. ФНО-α, называемый также кахектином, является пирогеном. Он во многом дублирует действие интерлдейкина-1, а также играет важную роль в патогенезе септического шока, вызванного грамотрицательными бактериями. Под влиянием ФНО-α резко увеличивается образование макрофагами и нейтрофилами перекиси водорода и других свободных радикалов. При хроническом воспалении он активирует катаболические процессы и тем самым способствует развитию кахексии - симптома многих хронических заболеваний.

Ген ФНО представлен одной копией на шестой хромосоме человека. Установлено тандемное расположение гена ФНО и гена лимфотоксина (ФНО-β) на шестой хромосоме. Ген лимфотоксина имеет две разновидности: ген лимфотоксина-α, который имеет сходную с геном ФНО экзон-интронную структуру. Степень аминокислотной гомологиии лимфотоксина-α и ФНО составляет около 30%, причем области выраженной гомологии локализуются в консервативных участках молекулы. Кроме того, известен ген лимфотоксина-β, кодирующий трансмембранный белок р33. Поскольку ФНО-β не имеет трансмембранного домена, он может удерживаться на мембране клеток благодаря образованию комплекса с трансмембранным белком р33.

Экспрессия гена ФНО регулируется на всех уровнях передачи информации: на уровне транскрипции, процессинга, трансляции, и на уровне секреции.

Продукция ФНО в макрофагах происходит постоянно, однако при индукции липополисахаридом она значительно повышается. Интересно, что хотя продукция ФНО в макрофагах активируется липополисахаридом более чем в 1000 раз, транскрипция гена по результатам этих работ активировалась всего в 2-3 раза, хотя уровень активации может быть выше - до 10 раз. Кроме того, что индукция макрофагов липополисахаридом приводит к двум событиям в регуляции транскрипции гена ФНО:

1) Увеличение количества молекул РНК-полимеразы II, инициирующих транскрипцию гена;

2) Повышение процессивности транскриптов (т. е. транскрипционный комплекс более эффективно доходит до конца гена), что приводит к формированию значительного количества зрелой мРНК. Ранее было показано, что некоторые активаторы транскрипции могут вносить вклад одновременно в увеличение скорости инициации и уровня процессивности транскриптов. Поэтому естественно было предположить, что в обоих компонентах индуцированной транскрипции гена ФНО должны принимать участие активаторы транскрипции, сайты связывания которых расположены в регуляторных областях гена, в первую очередь - перед промотором.

Последующие исследования, показали, что промотор гена ФНО имеет сложную модульную структуру. Наличие регуляторных элементов в промоторе гена ФНО, определяющих взаимодействие с разными транскрипционными факторами, предполагает возможность его дифференциальной регуляции в разных типах клеток и в ответ на разные стимулы. Таким образом, может обеспечиваться различный по силе биологический ответ, связанный с продукцией ФНО. Промоторы генов других цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8), продуцируемых макрофагами в ответ на бактериальную и другие инфекции, также имеют сложную структуру, что, возможно, определяет организацию специфической реакции организма на чужеродные раздражители на уровне транскрипции соответствующих генов.

В З'-нетранслируемой области мРНК ФНО находится область, состоящая из нескольких повторяющихся элементов типа (UUAUUUAU), который называют «UA-богатой последовательностью». Этот район консервативен для кДНК человека, более того, похожие области были обнаружены у мРНК многих воспалительных цитокинов и некоторых протоонкогенов. На примере одного из таких районов из 3'-нетранслируемой области было показано, что присоединение подобного участка к стабильной мРНК на порядок уменьшало время ее жизни. Замена же З'-нетранслируемой области гена ФНО на 3'-нетранслируемую область гена гормона роста в экспериментах по получению трансгенных мышей приводила к повышенной продукции ФНО, которая имела патологическое фенотипическое выражение. Повышение продукции ФНО, возможно, было отчасти связано со стабилизацией мРНК в цитоплазме при устранении данных элементов. Был постулирован общий принцип специфического гидролиза мРНК цитоплазматическими рибонуклеазами в UA-богатых районах, который имел место и в случае мРНК ФНО. На сегодняшний день известно всего несколько примеров природных изменений во времени жизни мРНК. Имеется, например, наблюдение, что на поздних стадиях индукции ЛПС время жизни мРНК ФНО значительно сокращалось, что могло обеспечивать более быстрое выключение синтеза ФНО. Также известно, что ингибитор протеинкиназы С, Н7, способствовал более быстрой деградации мРНК. Таким образом, в механизм стабилизации мРНК ФНО на одной из стадий внутриклеточной передачи сигналов вовлечена протеинкиназа С.

Существуют клетки, в которых ген ФНО транскрибируется конститутивно (т. е. транскрипция оперона, не требует присутствия индуктора из-за отсутствия функционально активного регуляторного белка вследствие мутации гена-регулятора). Причем, в некоторых тканях значительный уровень мРНК ФНО не сопровождается синтезом белка. Ингибирование трансляции было впервые показано для мРНК интерферона-бета и определялось наличием UA-богатой последовательности в З'-нетранслируемой области гена. Эффект подавления трансляции, по всей видимости, прямо не связан с рассмотренным ранее явлением нестабильности мРНК, хотя оба события и определяются UA-богатой последовательностью З'-нетранслируемой области гена. Помимо рибонуклеазы, с этим участком могут взаимодействовать специфические клеточные белки, которые изменяют конформацию мРНК таким образом, что она становится недоступной для трансляции. Проводились исследования регуляции трансляции ФНО, в ходе которых в качестве модели использовалась генно-инженерная конструкция, содержащая ген-репортер CAT под контролем конститутивного промотора, к которому была присоединена 3'-нетранслируемая область гена ФНО, содержащая UA-богатую последовательность. Химерная мРНК транскрибировалась конститутивно, поэтому активность белка CAT зависела лишь от эффектов на уровне трансляции. В неактивированных макрофагах продукция белка была подавлена, но при активации липополисахаридом могла быть индуцирована более чем в 100 раз. В отсутствии 3'-нетранслируемой области ФНО синтез белка CAT не зависел от липополисахарида. Таким образом, действие липополисахарида приводило к снятию репрессированного состояния мРНК ФНО, а обработка макрофагов липополисахаридом приводит к активации или синтезу de novo специфических белков, способствующих снятию репрессии трансляции ФНО. С другой стороны, конститутивная экспрессия ФНО в некоторых опухолевых клетках, определяется теми же белками-активаторами. Кроме того, эти белки могут обладать и другими биологическими активностями, например, поддерживать трансформированный фенотип клеток. Изменения в 3'-нетранслируемой области гена ФНО оказались способными вызывать патологические состояния, ассоциированные с повышенной продукцией ФНО.

После трансляции мРНК ФНО образуется пептидный предшественник, содержащий на своем N-конце дополнительные 76 аминокислот по сравнению с секретируемой формой белка ФНО. ФНО является типичным трансмембранным белком II типа. Благодаря наличию этой дополнительной последовательности аминокислот возможно заякоривание молекулы ФНО на поверхности клетки. Трансмембранный предшественник может подвергаться протеолитическому расщеплению, образуя растворимую форму белка ФНО. Предполагалось, что расщепление предшественника и секреция зрелого белка является этапом регуляции продукции ФНО. Также были опубликованы работы, указывающие на участие металлопротеиназ в расщеплении белка - предшественника растворимого ФНО. Оказалось, что специфическое ингибирование металлопротеиназ коррелирует с предотвращением секреции зрелого ФНО. Кроме того, показано участие Zn-зависимой эндопептидазы в процессе расщепления полипептида. В человеческих моноцитах линии Mono Mac 6 индукция ЛПС приводит к синтезу полноразмерного пептидного предшественника ФНО при отсутствии секреции зрелого белка. Быстрое освобождение зрелого цитокина наступало лишь при добавлении форболовых эфиров к клеткам, обработанным ранее липополисахаридом. Индукция протеинкиназы С после обработки форболовыми эфирами приводила к фосфорилированию и активации фермента, участвующего в протеолитическом расщеплении предшественника.

ФНО-α синтезируется в клетке в виде предшественника, включающего 233 аминокислотных остатка. Секреторная, лишенная лидерной последовательности форма состоит из 157 аминокислотных остатков. ФНО-β так же как и ФНО-α, синтезируется в клетке в виде предшественника, построенного из 247 аминокислотных остатков. Зрелая форма состоит из 171 аминокислоты.

В организме человека молекулы ФНО взаимодействуют со специальными ФНО-рецепторами, приводя к возникновению широкого спектра ответов клетки, включая активацию транскрипции генов и индукцию апоптоза. Надсемейство рецепторов ФНО содержит более 20 структурно родственных трансмембранных белков I-го типа, специфически активируемых соответствующими представителями ФНО-α-подобных цитокинов. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов-индукторов. Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами. Агенты, манипулирующие сигналом этих рецепторов, являются перспективными при лечении или предотвращении многих заболеваний человека, таких, как ревматоидный артрит, коронарные заболевания сердца, отторжение при трансплантации, невосприимчивость к инсулину, множественные повреждения органов, а также неоплазм.

Семейство ФНО-рецепторов составляют: ФНО-рецептор 1 и ФНО-рецептор 2, рецептор лимфотоксина Р, p75 (рецептор фактора роста нервов (NGF)), CD40, CD30 и CD27. Семейство этих белков постоянно пополняется. Были открыты еще три его члена: человеческий AРО-3, также называемый DR-3 (рецептор смерти), Wsl-1, человеческий HVEM (ранний медиатор вируса герпеса) и куриный CAR1 (cytopathic avian leukosis-sarcoma virus рецептор). К семейству ФНО-рецепторов относится и CD95/Fas/APO-1.

Надсемейство ФНО-рецепторов можно разделить на две подгруппы, в зависимости от того, содержит ли внутриклеточная область домен смерти. Содержащие домены смерти рецепторы известны как рецепторы смерти. Наиболее хорошо изученные рецепторы смерти – ФНО-рецептор 1 и Fas; в то время как ФНО-рецептор 1 индуцирует клеточную смерть лишь под воздействием определенных условий, более же часто он индуцирует активацию транскрипции генов, Fas является эффективным индуктором клеточной смерти. Не содержащие доменов смерти ФНО-рецепторы представлены ФНО-рецептором 2, CD40, CD30 и многими другими. Эти рецепторы вовлечены преимущественно в транскрипцию генов, ответственных за адаптацию клетки, ее рост и дифференцировку. Взаимодействие Fas-белка с FasL (Fas-лиганд – один из внешних факторов, запускающих в клетке апоптоз, лиганд белка CD95 (Fas/APO-1)) или с агонистическими моноклональными антителами к Fas также индуцирует в клетке апоптоз. Большинство других белков семейства ФНО-рецепторов передают сигналы активации или стимуляции клеток, хотя некоторые из них, такие как CD40 и CD30, имеют способность ингибировать клеточный рост, вызывая апоптоз. Функциональное сходство между Fas и ФНО-рецептором 1, а также наличие гомологичного домена в их цитоплазмлазматической части позволили сделать вывод о том, что этот район необходим для передачи сигнала апоптоза. Эти данные были подтверждены при помощи мутационного анализа Fas и ФНО-рецептора 1, и этот домен получил название «домен смерти». Домен смерти имеет тенденцию к самоагрегации. Он состоит из шести антипараллельных α-цепей с большим числом заряженных аминокислот на его поверхности, которые отвечают за агрегацию доменов смерти.

Во внеклеточной части молекул семейства ФНО-рецепторов содержится от двух до шести богатых цистеином доменов, аминокислотные последовательности которых весьма схожи у различных представителей семейства, в результате чего гомология этого района белков достигает 25%. Цитоплазматические же части рецепторов отличаются значительной вариабельностью. Исключение составляют CD95/Fas, ФНО-рецептор 1, APO-3/DR-3/Wsl-1 и CAR1, содержащие в цитоплазматическом районе молекул гомологичный домен (около 80 аминокислот), имеющий существенное значение для передачи апоптотического сигнала.

Сборка внутриклеточного сигнального комплекса белков надсемейства ФНО-рецепторов происходит в ответ на индуцируемую лигандом тримеризацию рецептора или олигомеризацию с большим числом мономеров. От ФНО-рецепторов передачу сигнала опосредует белок TRADD, который содержит два домена: домен смерти и полипролиновый домен. Домен смерти TRADD многофункционален и способен рекрутировать два дополнительных сигнальных белка: FADD и RIP. Белок FADD может прямо активировать каспазу-8, инициируя апоптоз, тогда как белок RIP возобновляет стимуляцию транскрипции генов путем активации сигнальных механизмов Nf-kB. Таким образом, ФНО индуцирует апоптоз и активирует транскрипционный фактор Nf-kB (ядерный фактор kB), а также стимулирует пролиферацию тимоцитов. Хотя оба ФНО-рецептора могут передавать сигнал как апоптоза, так и активации Nf-kB, в большинстве случаев передача этих сигналов осуществляется через ФНО-рецептор 1, в то время как ФНО-рецептор 2 отвечает за ФНО-индуцированную пролиферацию тимоцитов.

Изучение токсического действия липополисахарида на клетки привело к пониманию роли ФНО в опосредовании системной токсичности. Ряд патофизиологических исследований с использованием антител, способных нейтрализовывать действие ФНО, подтвердили центральную роль ФНО в возникновении токсического шока и, собственно, сепсиса.

Значительный уровень циркулирующего ФНО наблюдался у больных церебральной малярией, причем терапия с использованием антител к ФНО способствовала уменьшению церебральных осложнений. Не только бактериальная или паразитарная инфекции могут становиться более патогенными вследствие циркуляции ФНО, это возможно и в случае вирусных инфекций (например, активация репликации ВИЧ в Т-клетках под воздействием ФНО).

Также ФНО играет роль в развитии ряда аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит. С другой стороны, неоднократно было показано, что ФНО в соответствующих небольших дозах является важным медиатором защитной реакции организма при бактериальной, паразитарной и вирусной инфекции. Таким образом, применение ФНО в медицине ограничено его возможными вредными эффектами, наблюдающимися при использовании высоких доз цитокина. На сегодняшний день использование ФНО в противоопухолевой терапии определяется, прежде всего, возможностью устранения или значительного снижения его системной токсичности.

Однако, несмотря на это, разрабатываются подходы к решению этой проблемы.

Первый заключается в локальном применении ФНО в местах образования злокачественных опухолей с использованием либо комплексов ФНО с антителами, либо лимфоцитов, выделенных из опухоли пациента (инфильтрирующие опухоль лимфоциты) и трансформированных in vitro конструкцией, экспрессирующей ФНО. Эти лимфоциты при последующей инъекции преимущественно задерживаются в опухоли, что и обеспечивает локальную экспрессию ФНО и способствует противоопухолевой терапии.

Второй подход состоит в совместном применении ФНО с другими цитокинами (интерферонами, интерлейкином-2); химиотерапевтическими препаратами (мелфаланом, ингибиторами топоизомеразы II), радиотерапией. Комплексная терапия может привести к последовательному уменьшению эффективных доз ФНО или повышению эффективности оптимальной дозы.

Третья перспективная возможность состоит в использовании мутантных белков ФНО, которые обладают сходным терапевтическим эффектом, но значительно меньшей токсичностью, чем природные формы ФНО. В частности, уже охарактеризованы мутанты, которые предпочтительно взаимодействуют с одним из двух изученных рецепторов ФНО, а именно, ФНО-Р55. Максимальная доза ФНО, не вызывающая существенной токсичности, при задействовании только этого рецептора может быть повышена в 10-50 раз.

Важным клиническим аспектом изучения регуляции биосинтеза ФНО является специфическое ингибирование его продукции при целом ряде заболеваний, включая широкий спектр инфекций и аутоиммунных патологий. Открытие кахектиновой активности ФНО стимулировало разработку анти-ФНО терапии инфекционных и воспалительных заболеваний. Так рекомбинантный ФНО нашел применение в комбинированной противоопухолевой терапии меланомы конечностей, а фармацевтические компании проводят клинические испытания анти-ФНО препаратов на основе рецепторов или антител. Еще одним способом снижения системной токсичности является контролируемое местное применение ФНО, например применение рекомбинантного ФНО человека в терапии меланомы и саркомы конечностей с использованием региональной перфузии.

Таким образом, ФНО может быть как важным медиатором защитной реакции организма на различные виды инфекций, так и белком, обладающим пагубными для организма свойствами. Эффекты воздействия ФНО подобны эффектам при применении в целом хорошего лекарства, которое, может оказываться вредным при передозировке или неправильной временной терапии. Поэтому понимание механизмов регуляции продукции ФНО и возможность контролируемой экспрессии гена ФНО являются абсолютно необходимыми для успешного применения ФНО в терапии различных заболеваний.

 

Список использованной литературы:

1) Биологическая терапия в ревматологии; - Я.А.Сигидин, Г.В.Лукина; - Практическая медицина; - 2009 г.

2) Диффузные болезни соединительной ткани; - Я.А.Сигидин, - Н.Г.Гусева, М.М.Иванова; - Москва «Медицина»; - 2004 г.

3) https://www.medbiol.ru; - сайт «Биология и медицина».



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2017-12-12 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: