Тема занятия: Методы микробиологической диагностики хламидиозов и микоплазмозов.
Цель: Изучение методов микробиологической диагностики, терапии и профилактики заболеваний, вызванных хламидиями и микоплазмами.
Модуль 2. Специальная, клиническая и экологическая микробиология.
Содержательный модуль 10. Патогенные прокариоты и эукариоты.
Тема 40: Методы микробиологической диагностики хламидиозов и микоплазмозов.
Актуальность темы:
Хламидии, относятся к облигатным внутриклеточным паразитам, имеющим кокковидную форму, грамотрицательны. Геном хламидий составляет не более 15% размера генома кишечной палочки. Хламидии не могут синтезировать высокоэнергетические соединения и обеспечивать собственные энергетические потребности, но они способны самостоятельно синтезировать нуклеиновые кислоты, белки и липиды, что и позволило отнести их к бактериям. Вне клеток хламидий имеют сферическую форму (0,3 мкм), являясь элементарными тельцами. Внутри клеток они превращаются в делящиеся ретикулярные тельца, образуются их скопления-включения. У человека хламидий вызывают трахому, орнитоз и др. Хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе, их можно выявить и темнопольной микроскопией неокрашенных препаратов. Вне клеток хозяина метаболические функции сведены до минимума и трудны для выявления.
По современной классификации род включает 3 вида: Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae.
Жизненный цикл хламидий сложен и включает образование 2-х основных форм и обычно завершается в течение 40-72 часов.
Элементарное тельце (ЭТ) – мелкая (0,15–0,2 мкм) инфекционная внеклеточная форма. Характеризуется полимофизмом, метаболически мало активно и адаптировано к внеклеточному выживанию. ЭТ обеспечивает передачу заболевания от человека (животного) к человеку (животному), способно адсорбироваться на чувствительных эпителиальных клетках и проникать в них посредством эндоцитоза.
Ретикулярное тельце (РТ) – репродукционная внутриклеточная форма. Более крупное образование (до 1 мкм), развивается через 5-6 часов их ЭТ, проникшего в цитоплазму, претерпевшего структурные изменения и превратившегося в инициальное тельце (вегетативная форма). После образования РТ хламидийная клетка начинает активно бинарно делиться; продолжительность цикла деления составляет 18-24 часа. В результате образуются тельца включения в виде вакуолей в цитоплазме, содержащие делящие РТ. Обычно прилегают к ядру клетки и их можно выявить микроскопией («шапочка» на ядре).
После РТ трансформируется в промежуточное тельце, напоминающее бычий глаз. ПТ трансформируется в ЭТ. Выход ЭТ сопровождается гибелью клетки.
Микоплазмы - мелкие бактерии, окруженные цитоплазматической мембраной и не имеющие ригидной клеточной стенки. Они относятся к отделу тенерикутов, классу Mollicutes («мягкокожие»). Из-за отсутствия ригидной клеточной стенки микоплазмы осмотически чувствительны и имеют разнообразную форму: кокковидную, нитевидную, колбовидную. Эти формы можно рассмотреть при фазово-контрастной микроскопии чистых культур микоплазм. На плотной питательной среде микоплазмы образуют колонии, напоминающие яичницу-глазунью: непрозрачная центральная часть и погруженная в среду и просвечивающая периферия в виде круга.
Патогенные микоплазмы вызывают хронические инфекции. Mycoplasma pneumoniae является возбудителем заболевания по типу острой респираторной инфекции. Микоплазмы могут поражать не только людей и животных, но и растения. Достаточно широко распространены и непатогенные представители.
Возбудители орнитоза
Орнитоз (от греч. ornis - птица) - инфекционная болезнь, вызываемая Chlamydia psittaci, характеризующаяся интоксикацией, преимущественным поражением легких. Возбудитель орнитоза был выделен в 1930 г. от больных людей, заразившихся от попугаев (греч. psittakos - попугай).
Таксономия. Chlamydia psittaci относится к отделу Gracilicutes, роду Chlamydia.
Морфология и тинкториальные свойства. Возбудитель орнитоза имеет форму кокков диаметром 0,3-0,5мкм. Не образует спор, не имеет жгутиков и капсулы. Располагается внутри клеток, так как является облигатным внутриклеточным паразитом. Грамотрицателен, для окраски применяют метод Романовского-Гимзы.
Культивирование. С. psittaci является облигатным, внутриклеточным паразитом, поэтому его культивируют на куриных эмбрионах, в организме лабораторных животных, культуре клеток.
Антигенная структура. Возбудитель орнитоза имеет родоспецифический гликопротеиновый термостабильный антиген, локализующийся в клеточной стенке, и термолабильный видоспецифический антиген белковой природы, расположенный более поверхностно.
Факторы патогенности. С. psittaci образует токсическую субстанцию типа эндотоксина.
Резистентность. Возбудители инактивируются под действием дезинфицирующих средств, при нагревании, но довольно устойчивы к высушиванию, замораживанию. В окружающей среде сохраняются до 2-3 нед.
Эпидемиология. Орнитоз - широко распространенная зоонозная инфекция; источником инфекции являются многие виды домашних животных и диких птиц (более чем 170 видов). Наибольшее эпидемиологическое значение имеют городские голуби, попугаи, утки, индюшки. Основные передачи инфекции - воздушно-капельный и воздушно-пылевой, но возможен и пищевой. Восприимчивость к орнитозу высокая, чаще болеют люди среднего и старшего возраста. Заболевание встречается обычно осенью и весной. Преобладают спорадические случаи, но возможны и вспышки орнитоза.
Патогенез. Входными воротами инфекции являются верхние дыхательные пути. Возбудитель попадает в легочную ткань, где происходит его размножение, наблюдается интоксикация организма. В результате проникновения возбудителей в кровь они разносятся по всему организму, поражая различные органы - печень, селезенку, надпочечники, сердечную мышцу, нервную систему.
Клиническая картина. Инкубационный период продолжается от 6 до 17 дней. Заболевание чаще протекает в виде тяжелой пневмонии. Иногда в патологический процесс вовлекаются сердечно-сосудистая система, печень, селезенка, возможно развитие серозного менингита. Могут наблюдаться как острые, так и хронические формы инфекции.
Иммунитет. После перенесенного заболевания вырабатывается нестойкий иммунитет, поэтому возможна реинфекция.
Микробиологическая диагностика. Основным методом диагностики является серологический метод (РСК, РТГА). Возможно применение бактериологического и аллергического методов.
Лечение. Назначают антибиотики.
Профилактика. Проведение неспецифических мероприятий: регулирование численности голубей, санитарно-ветеринарные мероприятия в птицеводстве и т. д.
Возбудитель трахомы
Трахома (от греч. trachys - неровный, шероховатый) - хроническое инфекционное заболевание глаз, вызываемое Chlamydia trachomatis, характеризующееся поражением роговицы и конъюнктивы с образованием фолликулов (трахоматозных зерен), изъязвление которых приводит к рубцеванию.
Возбудитель трахомы. С. trachomatis, открытый в 1907 г. С. Провацеком и Л. Хальберштедтером, относится к семейству Chlamydiaceae, отделу Gracilicutes.
Морфология и культивирование. Возбудитель трахомы - грамотрицательная мелкая бактерия; внутриклеточный облигатный паразит. Размножаясь в клетках эпителия роговицы глаза, образует включения - тельца Провацека, окрашивающиеся по Романовскому-Гимзе в фиолетово-синий цвет с красными зернышками.
Культивируется в куриных эмбрионах, культурах клеток конъюнктивы глаза.
Антигенные свойства. Возбудитель трахомы имеет родоспецифический, видо- и вариантоспецифический антигены (серовары), обозначаемые как С. trachomatis А, В, Ва, С.
Возбудитель относительно нестоек, инактивируется при действии физических и химических факторов.
Эпидемиология. Трахома известна давно; заболевание распространено повсеместно, имеются эндемические очаги; в настоящее время заболевание носит спорадический характер. Болеют только люди. Источник инфекции - больные и носители. Заражение происходит контактно-бытовым (прямым или косвенным) путем - через руки, предметы обихода (полотенца, одежду и др.).
Патогенез и клиническая картина. Заболевание связано с повреждающим действием хламидий на эпителиальные клетки конъюнктивы и роговицы с последующим распространением процесса на лежащие более глубоко ткани.
Инкубационный период составляет 7-14 дней. Поражаются обычно оба глаза. В начале заболевания могут появляться ощущение инородного тела и чувство жжения в глазах. Возможно и острое начало: светобоязнь, слизисто-гнойное отделяемое. Развиваются конъюнктивит и кератоконъюнктивит, сопровождающиеся изъязвлением и рубцеванием, что может привести к образованию бельма и слепоте.
Микробиологическая диагностика. Возбудитель обнаруживается в цитоплазме клеток эпителия конъюнктивы в форме включений - телец Хальберштедтера-Провацека.
Наиболее простой способ выявления С. trachomatis в исследуемом материале – окрашивание образцов раствором Люголя, выявляющее скопление гликогена. В окрашенных препаратах тельца включения выглядят как одиночные коричневые округлые тела, расположенные внутри клеток. Также хламидии можно окрашивать и по Романовскому-Гимзе. Выделяют возбудители из соскобов конъюнктивы путем заражения куриного эмбриона. Используют РИФ для обнаружения возбудителя в соскобах конъюнктивы или антител в сыворотке больного.
Лечение и профилактика. Наиболее эффективны тетрациклины в виде мазей, рифампицин и сульфаниламиды. Специфическая профилактика отсутствует. Неспецифическая профилактика заключается в проведении просветительной работы, контроле за соблюдением гигиенических требований в семейных очагах.
Урогенитальный хламидиоз
Урогенитальный хламидиоз - широко распространенное заболевание мочеполового тракта, вызываемое определенными сероварами.
Таксономия. Бактерии, относящиеся к отделу Gracilicutes, роду Chlamydia.
Культуральные и биохимические свойства возбудителей урогенитального хламидиоза те же, что и возбудителей других хламидиозов (трахома, орнитоз и др.).
Антигенные свойства. Возбудители урогенитального хламидиоза по антигенным свойствам принадлежат сероварам С. trachomatis, обозначаемым от D до К включительно.
Эпидемиология. Антропонозная инфекция. Источник - больные люди, главным образом женщины, с малосимптомным течением болезни. Механизм заражения - половой. Передача инфекции происходит половым путем, но возможен и контактно-бытовой путь (при купании в бассейне хламидии проникают в конъюнктиву). Хламидии могут инфицировать плод во время беременности больной матери.
Патогенез. Хламидии проникают через слизистые оболочки урогенитального тракта, а также через конъюнктиву. Возбудители вызывают воспаление уретры, шейки матки, придатков, предстательной железы, конъюнктивы.
Клиническая картина. Длительность инкубационного периода 7-14 дней. Появляются выделения, зуд, гиперемия слизистых оболочек. Заболевание часто переходит в хроническую форму.
Иммунитет после выздоровления не формируется.
Микробиологическая диагностика. Методы исследования: культуральный (на культуре клеток), серологический (ИФА, РПГА, РСК с парными сыворотками). Наиболее часто применяют РИФ и ИФА для обнаружения хламидийного антигена в отделяемом из слизистых оболочек.
При конъюнктивите применяют микроскопию соскоба конъюнктивы для выявления внутриклеточных включений - телец Провацека-Хальберштедтера.
Лечение. Антибиотики широкого спектра действия.
Профилактика неспецифическая.
Венерическая лимфогранулема
Венерическая лимфогранулема (ВЛГ) - заболевание половых органов и регионарных лимфатических узлов, вызываемое С. trachomatis сероваров L1 и L2, т.е. возбудитель ВЛГ отличается от других хламидии только по антигенным свойствам.
Эпидемиология. Источник инфекции - больной человек. Заражение происходит преимущественно половым путем, реже через предметы обихода. Встречается в странах с жарким и влажным климатом, отличается высокой контагиозностью.
Патогенез и клиническая картина. Входные ворота - слизистая оболочка половых органов. Инкубационный период - до 30 дней. На половых органах появляются папулы, язвочки. Увеличиваются регионарные лимфатические узлы.
Иммунитет после заболевания стойкий. Микробиологическая диагностика: используют бактериологический и серологический методы.
Лечение - антибиотики.
Профилактика неспецифическая.
Возбудитель микоплазмоза
Микоплазмоз - инфекционная болезнь, вызываемая Mycoplasma pneumoniae. Возбудитель впервые выделен в 1944 г. М. Итоном и отнесен к вирусам, только в 1962 г. идентифицирован как микоплазма.
Возбудитель относится к отделу Tenericutes, семейству Мусоplasmataceae, роду Mycoplasma; М. pneumoniae - единственный вид этого рода, патогенность которого для человека доказана.
Микоплазмы представляют собой мелкие сферические и нитевидные клетки. У них отсутствует ригидная клеточная оболочка, вместо которой они покрыты трехслойной мембраной. Благодаря этому микоплазмы могут менять форму и даже проходить через бактериальные фильтры. Микоплазмы резистентны к пенициллину, но тетрациклин и эритромицин угнетают их рост. Культивируются на сывороточном агаре с добавлением ацетата таллия для подавления посторонней флоры (при первичном посеве материала от больного на плотной среде через 1-2 нед вырастают мелкие колонии с втянутым в среду центром, напоминающие «яичницу глазунью»
Источником инфекции является человек, больной пневмонией, или носитель. Заболевание распространяется воздушно-капельным путем. Материалом для исследования может служить мокрота и носоглоточная слизь. Диагноз может быть также подтвержден серологическими методами (РСК, РИФ, РПГА).
Этиотропное лечение осуществляется антибиотиками (эритромицин и тетрациклин). Специфическая профилактика не разработана.
Возбудитель негонококковых уретритов:
Ureaplasma urealyticum – раньше относился к роду Mycoplasma.
Морфология. В настоящее время выделяют 3 основных типа: мелкие (120-150нм) с гомогенной цитоплазмой, включающей значительное количество рибосом; средние (500-750 нм), характеризующиеся периферическим расположением рибосом; крупные с негомогенной цитоплазмой и выраженным генофором.
Культуральные свойства: Особенность уреаплазм – способность к быстрому росту в оптимальных условиях. Температурный оптимум 37оС, при незначительном защелачивании среды клетки быстро погибают. Факультативные анаэробы. Для культивирования используют среды, содержащие гидролизат бычьего сердца, гидролизат казеина и др. Среды дополняют внесение 10% лошадиной сыворотки. Размножение возбудителя в жидких средах приводит к изменению окраски среды с лимонно-желтой на синюю. Жизнеспособность клеток в жидких культурах не превышает 3-5 суток. Для культивирования используют сердечно-мозговой агар, среду Клодницкого, сывороточный бульон и культуру клеток.
Антигенная структура сложная, в настоящее время выделяют 16 сероваров, разделенных на две группы (А и В).
Эпидемиология: Результаты многочисленных исследований, направленных на выявление Ureaplasma urealyticum у больных и клинически здоровых лиц, показывают на инфицированность 25-80% лиц, ведущих активную половую жизнь и имеющие 3-х и более партнеров. Путь передачи – половой. Основной резервуар – больные лица.
Клиника: В настоящее время полагают, что Ureaplasma urealyticum является причиной более 50% уретритов у мужчин. Частое проявление инфекции уреаплазменные простатиты. У женщин инфекции протекают стерто.
Лабораторная диагностика Основной метод диагностики уреаплазмозов – метод определения уреазной активности (образование аммиака из мочевины). Из серологических методов используют РСК и РНГА с сывороткой крови больного.
Лечение: тетрациклины, макролиды и фторхинолоны.
Конкретные цели:
· Изучить цикл развития хламидий.
· Изучить морфологическую характеристику всех форм хламидий.
· Изучить морфологию микоплазм.
· Изучить методы микробиологической диагностики.
· Трактовать результаты микроскопического исследования.
· Ознакомиться с методами профилактики и специфической терапии.
Уметь:
· Дифференцировать зараженные хламидиями клетки от здоровых в микроскопических препаратах
· Забирать материал для исследования от больных
· Трактовать результаты микроскопического исследования
Теоретические вопросы:
1. Возбудитель.
· Свойства. Резистентность.
· Патогенность для человека и животных. Факторы патогенности, токсины.
· Патогенез заболевания у людей, иммунитет.
· Микробиологическая диагностика.
· Специфическая профилактика и лечение
Практические задания, которые выполняются на занятии:
1. Микроскопия демонстрационных препаратов.
2. Изучение коллекции питательных сред для выращивания культуры клеток.
3. Изучить строение куриного эмбриона и овладеть техникой его заражения.
4. Зарисовка демонстрационных микропрепаратов в протокол.
5. Разбор схем лабораторной диагностики
6. Оформление протокола.
Литература:
1. Коротяев А.И., Бабичев С.А., Медицинская микробиология, иммунология и ви-усология /Учебник для медицинских ВУЗов, Ст-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.
2. Тимаков В.Д., ЛевашевВ.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.-2-е изд., перераб. и доп.- М.:Медицина, 1983,- 512с.
3. Пяткин К.Д. Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и иммунологией.- Киев: Вища школа, 1992.- 431с.
4. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.- М.:ГЕОТАР-МЕД, 2001.- 768с.
5. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, иммунологии и вирусологии. /Под ред. М.П. Зыкова.- М. «Медицина». 1977.– 288с.
6. Черкес Ф.К., Богоявленская Л.Б., Бельскан Н.А. Микробиология. /Под ред. Ф.К. Черкес.– М.: Медицина, 1986.– 512с.
7. Конспект лекции.
Дополнительная литература:
1. Макияров К.А. Микробиология, вирусология и иммунология.- Алма-Ата.: «Ка-захстан», 1974.– 372с.
2. Тiтов М.В. Iнфекцiйнi хвороби.- К., 1995.– 321с.
3. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.- М.: Медицина, 1990.- 559с.
4. БМЭ, Т. 1, 2, 7.
5. Павлович С.А. Медицинская микробиология в графах: Учеб. пособие для мед. ин-тов.– Мн.: Выш. шк., 1986.– 255с.