МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
Институт биологии и биомедицины
Направление: Биология
ОТЧЕТ
По производственной профильной практике
01.02.16 – 14.02.16
Группа: 371314-7
Студент: Ярков Роман Сергеевич
Руководитель от ИББМ: к.б.н. Митрошина Е. В.
Руководитель от базы практики: к.б.н. Митрошина Е.В.
Оценка ____________________
Нижний Новгород 2016 г.
Оглавление
Введение. 3
Цель. 3
Задачи. 3
Основные методы исследования. 4
Посадка диссоциированных клеток на покровные стекла. 4
Оценка жизнеспособности клеточных культур. 7
Иммуноцитохимическая окраска клеточных культур. 8
Микроскопия сверхвысокого разрешения (STORM) 10
Результаты.. 11
Введение
Учебная практика длительностью в две рабочие недели, с 01.02.2016 по 14.02.2016 проходила в отделе молекулярно-клеточных технологий центральной научно – исследовательской лаборатории нижегородской государственной медицинской академии.
Во время практики был пройден подробный инструктаж по работе в стерильном помещении. Так же были освоены некоторые методы цитологических исследований, а именно: посадка диссоциированных клеток на покровные стекла, оценка жизнеспособности клеточных культур, иммуноцитохимическая окраска клеточных культур и микроскопия сверхвысокого разрешения (STORM). Данные методы исследований необходимы для дальнейшего изучения взаимодействия эндогенной каннабиноидной системы и системы нейротрофических факторов при ишемическом повреждении центральной нервной системы.
Цель
Освоить методы исследований, необходимые для дальнейшего изучения взаимодействия эндоканнабиоидной системы и системы нейротрофических факторов при ишемическом повреждении центральной нервной системы.
Задачи
Освоить методы работы в стерильном помещении, освоить методики создания первичных культур клеток гиппокампа мышей. Освоить методы определения жизнеспособности клеточных культур, ознакомится с методами иммуноцитохимии и микроскопии сверхвысокого разрешения (STORM).
Основные методы исследования
Посадка диссоциированных клеток на покровные стекла
В ходе практики был освоен метод посадки диссоциированных клеток гиппокампа на покровные стекла, для дальнейшего культивирования. В этот метод входят такие процедуры как: препарирование матки беременной мыши, извлечение эмбрионов из матки, извлечение гиппокампов из мозга эмбрионов, гомогенизирование гиппокампов и дальнейшая их высадка в питательную среду.
Ход работы:
1. Для проведения посадки первичных культур необходимо подготовить стерильную посуду и инструменты: в течение 1,5 часов при 1400С простерилизовать в сухожаровом шкафу стеклянные чашки Петри (90 мм) - 5 шт., стеклянные пипетки - 3 шт., пробирки стеклянные - 5 шт., пинцеты хирургические глазные с острыми браншами - 5 шт., скальпели №20, №11, №10 - по 1 шт., ножницы хирургические - 4 шт., пинцеты с загнутыми концами - 4 шт, стекла с лунками - 2 шт., покровные стекла - в количестве, соответствующем планируемому числу культур.
2. Надеть средства индивидуальной защиты (стерильный хирургический костюм, перчатки, маску). Все манипуляции при работе с клетками выполнять в специальном стерильном помещении (боксе), в ламинарном шкафу для обеспечения асептики. Руки в хирургических перчатках необходимо периодически обрабатывать 70% спиртом в течение всей работы.
3. В ламинарном шкафу приготовить 25 мл питательной среды для посадки культуры: 23,50 мл Neurobasal medium (Invitrogen) + 125 мкл L-glutamine (Sigma) + 1,25 мл телячьей эмбриональной сыворотки (ПанЭко) + 250 мкл питательной добавки B-27 (Invitrogen). Профильтровать приготовленную среду с помощью стерильной шприцевой насадки.
4. Приготовить стерильный фосфатно-солевой буферный раствор с помощью стерильной шприцевой насадки.
5. Выделение гиппокампа:
6. Взять выделенные из матки эмбрионы. Положить эмбрион на брюшную сторону на стерильное препаровальное стекло головой вперед. Дальнейшие манипуляции выполнять под стереомикроскопом.
7. Придерживая эмбрион в области шеи стерильным пинцетом в левой руке, сделать разрез кожи в затылочной области правым пинцетом.
8. Удерживая левым пинцетом эмбрион в области шеи, убрать кожу, затем кости черепа справа, затем слева над полушариями, начиная с срединной линии.
9. Головной мозг извлечь с помощью стерильного скальпеля и положить в чашку Петри со стерильным фосфатно-солевым раствором.
10. Взять стерильную чашку Петри с препаровальным стеклом с лункой.
11. Положить мозг дорсальной поверхностью кверху на препаровальное стекло в передней половине стекла.
12. Сделать небольшой надрез в нижнемедиальной части между полушариями.
13. Отвернуть сначала правое полушарие, а затем левое полушарие, отрезав скальпелем их соединение с подлежащими тканями в нижней латеральной части мозга.
14. Перевернуть правое полушарие на дорсальную сторону.
15. Отделить кору от гиппокампа слева и справа.
16. Снять сосудистую оболочку мозга.
17. Повторить то же самое с левым полушарием.
18. Выделенные гиппокампы сложить в лунку препаровального стекла в каплю фосфатно-солевого буферного раствора.
19. Пипеткой убрать оставшиеся ткани мозга с передней части препаровального стекла.
20. Повторить процедуру выделения левого гиппокампа, начиная с п.13.
21. Собрать в лунке необходимое количество гиппокампов и размельчить их с помощью пинцета и скальпеля до однородной массы.
22. Размельченные гиппокампы собрать с помощью второй пипетки и поместить в раствор 0,25% трипсина, закрыть пробирку и поставить пробирку в инкубатор при 35,50С на 20 мин.
23. Достать через 20 мин из инкубатора суспензию клеток в трипсине и убрать надосадочную жидкость с помощью второй пипетки. Отмыть трижды фосфатно-солевым буферным раствором второй пипеткой.
27. Добавить стерильную культуральную среду и оставить в ламинарном шкафу на 1,5 мин. Пробирку закрыть крышкой.
28. Убрать надосадочную жидкость второй пипеткой, добавить в пробирку 2 мл культуральной среды и суспендировать в течение 1 мин третьей пипеткой (либо дозатором с насадкой на 200 мкл).
29. Центрифугировать в течение 3 мин при g=800 об/мин. Убрать надосадочную жидкость и добавить среду из расчета 40мкл суспензии на матрицу. Раскапать суспензию клеток на подготовленную матрицу. Плотность клеток для исследования должна составлять 9000 клеток/мм2.
30. Поставить в инкубатор на 2 часа.
31. После инкубирования в течение 2 часов долить по 1000 мкл среды/матрицу.
32. Поддержание жизнеспособности культуры гиппокампа осуществляется в условиях СО2 инкубатора при температуре 35,5оС и газовой смеси 95% воздуха и 5%СО2, 100% влажности. Смена культуральной среды на среду для длительного культивирования с меньшим содержанием сыворотки (98,4% Neurobasal medium + 0,1 % эмбриональной телячьей сыворотки + 1% B27 + 0,5% L-глутамин) осуществляется через сутки после посадки на матрицу и далее 1 раз в 2 дня. После двух недель культивирования в связи с повышением функциональной активности и быстрым закислением среды смена среды осуществляется ежедневно.