Алгоритм подготовки заливочных сред.

1. Фиксация (от лат. fixatio — закрепление) — фрагмент ткани обрабатывают с помощью жидкости-фиксатора, в роли которого чаще всего выступает формалин, реже — спирты, пикриновая кислота и др. Такая обработка предотвращает распад клеток и разрушение структуры ткани под действием собственных ферментов клеток и процессов гниения, таким образом сохраняя прижизненную структуру и делая возможным изучение ткани. Принцип действия фиксирующих жидкостей основан на быстрой гибели клеток и коагуляции белка. Наиболее распространенный тип фиксации — иммерсионная фиксация (от лат. immersio — погружение), при которой фрагмент ткани целиком погружается в раствор; в экспериментальных условиях также используют перфузионную фиксацию (от лат. perfusio — вливание), при которой фиксатор вводят через сосудистую систему^[1]. При этом используют как технический формалин (марка ФМ ГОСТ 1625-89), так и подготовленный («забуференный» формалин), который отличается большей стабильностью — не образуется белый осадок, свойственный техническому формалину при температуре ниже 40 °С.

2. Проводка — процесс дегидратации (обезвоживания) фрагмента ткани и пропитки его парафином. Этот этап обеспечивает уплотнение ткани, которое, в свою очередь, необходимо для получения срезов (если ткань будет излишне мягкой, то при микротомировании она будет «сминаться», образуя складки, разрывы и другие артефакты, делающие её непригодной к изучению). Традиционно проводку осуществляли путем последовательного погружения ткани в растворы ксилолаи этилового спирта^[1], однако такой метод имеет ряд существенных недостатков, как-то: трудоемкость, длительность (до четырёх суток)^[2], испарение реагентов в воздух лаборатории (что небезопасно для сотрудников лаборатории, так как ксилолы образуют взрывоопасные паровоздушные смеси, вызывают острые и хронические поражения кроветворных органов, при контакте с кожей — дерматиты)^[3], а также нестабильное качество получаемой ткани, зависящее отчеловеческого фактора, а именно действий лаборанта. Для решения проблем такого рода лаборатории используют альтернативные реагенты, такие какизопропанол, являющийся нетоксичным, а также аппараты — гистопроцессоры, имеющие закрытый контур и таким образом не допускающие испарений в воздух лаборатории. Путем использования гистопроцессоров также можно значительно уменьшить время проводки по сравнению с ручным методом (до одного часа при использовании гистопроцессора Xpress 120^[4]) за счет применения вакуум-инфильтрационной и микроволновой методик.

3. Заливка — процесс создания блока, достаточно твердого, чтобы быть пригодным для резки (микротомирования). Выполняется путем заливания фрагмента ткани жидким парафином, целлоидином, пластмассой или специальными средами для заливки. Затем залитую ткань остужают до затвердевания блока. Целлоидин в настоящее время практически не используется; чистый парафин также обладает рядом недостатков, делающих его непригодным для исследования — при его затвердевании образуются кристаллы, уменьшающие его объём на 5—10 %, что, в свою очередь, ведет к деформации ткани^[5], а также из-за кристаллической структуры он легко крошится при резке. Поэтому чаще всего для изготовления блоков пользуются специальными заливочными средами, представляющими собой смесь парафинов с присадками в виде рисового, пчелиного воска или полимеров. Эти присадки придают парафину эластичность, что не дает ему крошиться при резке. Чтобы создать гомогенную среду для заливки, воск и парафин расплавляют, охлаждают и тщательно перемешивают, повторяя всю процедуру 5—10 раз. Это достаточно трудоемкий процесс, качество получаемой среды нестабильно, поэтому некоторые лаборатории пользуются готовыми средами для заливки, изготовленными в заводских условиях и не требующих дополнительной гомогенизации.

4. Резка, или микротомирование, представляет собой изготовление тонких срезов на специальном приборе — микротоме. Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4—5 мкм, для электронной — 50—60 нм.

5. Окрашивание срезов позволяет выявить структуру ткани за счет неодинакового химического сродства различных элементов ткани к гистологическим красителям. Например, окраска гематоксилином и эозином позволяет выявить кислые структуры ткани, такие как ДНК и РНК, за счет их связывания с гематоксилином, имеющим щелочную реакцию, и цитоплазму клеток, которая связывается с эозином^[6] (основная статья — окраска гематоксилином и эозином). Перед окрашиванием выполняется монтирование среза на предметное стекло. Для избежания формирования складок срез после микротомирования помещают на поверхность подогретой воды, где он расправляется, а потом уже на стекло. Окрашивание, как и все остальные стадии процесса изготовления гистологического препарата, может выполняться вручную и автоматически. Различают традиционное окрашивание и иммуногистохимическое.

6. Заключение срезов представляет собой помещение окрашенного среза, монтированного на предметном стекле, под покровное стекло с использованием среды для заключения, имеющей коэффициент преломления, близкий к таковому у стекла — канадский бальзам, полистирол, специальные среды для заключения. Заключенный препарат можно хранить достаточно длительное количество времени (исключение — при использовании полистирола препарат постепенно теряет прозрачность, а сам полистирол трескается. Данные изменения при заключении полистиролом значительно уменьшаются если в полистирол добавить пластификатор например дибутилфталат, при таком условии срок годности гистопрепарата увеличивается до 10 лет даже без покровного стекла, в течение 3 лет изменений практически не происходит).

Заливка ткани в парафин