МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА
Независимо от способа культивирования с момента засева продуцентом стерильной питательной среды ведется контроль за ростом культуры и образованием ферментов. Контроль осуществляется и на каждой следующей стадии получения фермента (чистота, стерильность, ферментативная активность).
Контроль отобранных проб
Для каждого вида продуцента и способа культивирования устанавливается своя периодичность отбора проб растущей культуры. Отобранные пробы подвергаются микроскопированию и визуальному просмотру. С целью выявления возможных заражений производится периодический высев проб на агаризованные среды с введением факторов, подавляющих рост продуцента.
Контроль ферментативной активности
Постоянно ведется определение накопления в культуре ферментативной активности. Для определения ферментативной активности используют следующие методы:
1. Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (О-гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров).
2. Спектрофотометрический метод – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при характеристической длине волны (лиазы – по образованию двойной связи).
3. Манометрический метод – определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О2, декарбоксилазы – по выделению СО2).
4. Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза).
5. Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.).
Контроль компонентов среды
При глубинном культивировании ведут контроль за потреблением основных лимитирующих компонентов среды (углеводы, N, Р), измеряют рН культуры, постоянно наблюдают температуру процесса и поддерживают необходимую. Для этого существуют специальные датчики и электроды, чтобы отслеживать процесс в реальном времени и не отбирать пробы. Существуют датчики температуры, оптической плотности, pH, pO2, а также датчики, определяющие концентрацию различных веществ. В ином случае берут пробы, очищают и титруют.
Рис. 1. Датчик температуры
Рис. 2. Цифровой датчик pH
Рис. 3. Биореактор
Фиксирование результатов контроля
Все показатели роста культуры, изменения состава среды и накопления ферментов и т. д. заносятся в лабораторный журнал.
Лабораторный журнал – официальный документ, имеющий юридическую силу, в котором в последовательном хронологическом порядке указываются условия проведения экспериментов и результаты измерений. Аккуратное ведение лабораторного журнала позволяет исследователю создать адекватный и поддающийся проверке отчет, защитить свой приоритет относительно сделанных им анализов.
Лабораторный журнал представляет собой тетрадь (журнал) с пронумерованными страницами, прошитыми страницами толстой ниткой, концы которой скреплены на последней странице сургучом с оттиском официальной печати учреждения. Данные следует вписывать ручкой, но не карандашом. Если в процессе занесения в журнал результатов эксперимента были позже обнаружены опечатки или фактические ошибки, они исправляются ручкой другого (красного) цвета, ставится дата и фамилия исправляющего.
Контроль обсемененности
На всех стадиях выделения ферментов проводят анализы активности, определяют величины потерь и выход товарного продукта. Готовые препараты ферментов подвергают тщательному исследованию, особенно те, которые применяются в медицине и в пищевых продуктах. Препараты медицинского назначения не должны содержать микроорганизмов. Препараты для хлебопекарной, мясной и рыбной промышленности контролируют на содержание спор грибов-продуцентов и на присутствие спороносных бактерий. Споры или клетки продуцента в готовом продукте должны отсутствовать, а предельная норма обсемененности микрофлорой определяется в каждом конкретном случае.
Например, в грибных препаратах из поверхностных культур она не должна превышать 1-105 клеток на I г препарата. При контроле готовых препаратов на обсемененность микроорганизмами делают высевы проб от каждой партии на твердые среды (МПА и сусло-агар) в чашки Петри. Заражение выражается количеством микроорганизмов на 1 г препарата. Контроль на зараженность спороносными бактериями проводятся путем высева нагретых до 80 С проб на чашки Петри с агаризированной средой. Культивирование для выявления бактериального заражения ведут при 37 °С в течение 24 ч, а для грибного — при 30 °С в течение 48—72 ч. Чашки обычно подписывают датой высева.