Лабораторная работа № 1
Обнаружение пероксидазы в соке клубня картофеля
Пероксидаза играет важную роль в окислительно-восстановительных процессах, протекающих в растительном организме при дыхании и брожении, т.е. она является дыхательным ферментом. Она способна окислять органические соединения лишь с помощью каких-либо органических перекисей. В растениях перекись водорода образуется под действием оксидаз (полифенолоксидаза, монофенолоксидаза). Пероксидаза вместе с перекисью водорода образует комплексные соединения, в результате чего перекись активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода. Она может окислять полифенолы и некоторые органические амины. Например, под действием пероксидазы и перекиси водорода гидрохинон переходит в интенсивно буро окрашенный хинон.
Цель работы: обнаружить присутствие пероксидазы в соке клубней картофеля.
Материалы и оборудование: 1 % раствор гидрохинона, 3 % раствор перекиси водорода, вода. Пробирки – 5 шт. на стол, скальпель, пипетки, пластиковые тарелки, терка (желательно-пластиковая), марля.
Растения: клубни картофеля.
Ход работы:
На терке натирают очищенный клубень картофеля. Из мезги через марлю отжимают сок и собирают в коническую колбу на 50 мл.
В штативе нумеруют пять пробирок. В первую приливают 1 мл картофельного сока, 5 мл 1 % раствора гидрохинона и 1 мл 3 % раствора перекиси водорода. Во вторую – 5 мл 1 % раствора гидрохинона и 1 мл 3 % раствора перекиси водорода. В третью – 1 мл картофельного сока и 5 мл 1 % раствора гидрохинона. В четвертую – 1 мл предварительно прокипяченного в течение 1 мин картофельного сока и 1 мл перекиси водорода. В пятую – 1 мл картофельного сока.
При окислении гидрохинона в хинон раствор буреет. Наблюдается некоторое побурение самого картофельного сока без добавления гидрохинона и пероксида водорода, что связано с действием полифенолоксидазы, окисляющей полифенолы тканей картофеля с участием молекулярного кислорода.
Лабораторная работа № 2
Определение содержания рутина в листьях чайного куста
В растениях имеется группа природных соединений, принадлежащих к флавоновым пигментам (биофлавоноидам) и имеющих полифенольный тип строения. А.В. Палладиным было установлено, что в процессе дыхания растений участвуют в качестве промежуточных звеньев вещества циклического строения, способные окисляться и восстанавливаться, являясь, таким образом, переносчиками водорода от субстрата к кислороду с образованием воды, меняя при этом свою окраску. Эти вещества А.В. Палладии назвал «дыхательные хромогены». По своему химическому строению дыхательные хромогены являются производными фенолов и были объединены под общим названием «полифенолы». К их числу относится рутин (витамин Р) - кристаллическое вещество желто-оранжевой окраски. Особенно много веществ с Р-витаминным действием в листьях чая, листьях и цветах гречихи, плодах шиповника, в коре лимона, в незрелых плодах грецкого ореха (мякоти) и др. Количественное определение рутина основано на его способности окисляться перманганатом. В качестве индикатора применяется индигокармин, который вступает в реакцию с перманганатом после того, как окислится весь рутин.
Цель работы: обнаружить присутствие рутина в листьях чайного куста.
Материалы и оборудование: колба коническая на 100 мл; 0,05 н раствор перманганата калия; индикатор индигокармин (0,25 % раствор в 50 % этаноле); коническая колба на 50 мл; пипетка на 10 мл; бюретка.
Растения: чай крупнолистовой.
Ход работы:
К 100 мг листьев чая приливают 50 мл горячей дистиллированной воды и проводят экстракцию в течение 5 мин. Отбирают 10 мл экстракта чая и переносят в коническую колбу, добавляют 10 мл дистиллированной воды и 10 капель индигокармина. Пробу титруют 0,05 н раствором перманганата калия до появления устойчивой желтой окраски.
Процентное содержание рутина рассчитывают по формуле:
Х=3,2*A*V1 *100/ V2 *m*1000
где: Х – содержание витамина Р, мг%; А – количество 0,05н раствора перманганата калия, пошедшее на титрование, мл; m – количество сухого чая, взятого для анализа, г; V 1 – объем вытяжки, взятой для титрования, мл; V 2 – объем воды, добавленной к сухому чаю для экстракции, мл; 100 – коэффициент для вычисления процентного содержания; 1000 – коэффициент для перевода в мг.
Лабораторная работа № 3
Обнаружение дегидрогеназ в семенах фасоли
Дегидрогеназы – это ферменты, активирующие и отщепляющие водород от окисляемого субстрата. Обнаружение дегидрогеназ основано на их способности передавать водород какому-нибудь акцептору, который, восстанавливаясь, меняет свою окраску. В качестве акцептора водорода может быть взята метиленовая синь, переходящая в восстановленном состоянии в бесцветную лейкоформу.
Цель работы: обнаружить присутствие дегидрогеназ в живых семенах фасоли.
Материалы и оборудование: 1 % раствор метиленовой сини, электроплитка, нагретая до 25 – 30 ºС водяная баня, пробирки – по 2 на стол, резиновые пробки для пробирок, химические стаканы.
Растения: набухшие суточные семена фасоли.
Ход работы:
С набухших семян фасоли снимают кожуру. Часть семян убивают кипячением в течение 10 минут (в химическом стакане на электроплитке). Затем по 3 шт. живых (опытных) и убитых (контрольных) семян помещают в две пронумерованные пробирки, заливают 1 % раствором метиленовой сини, выдерживают 10 минут. Через 10 минут раствор метиленовой сини из пробирок сливают, семена промывают водопроводной водой. После промывания все семена должны иметь темно-синюю окраску. Окрашенные семена в пробирках заливают водой, пробирки закрывают пробками и ставят на водяную баню с температурой 25 – 30 ºС.
Через 1,5–2 часа можно заметить, что непрокипяченные семена теряют синюю окраску. Это происходит потому, что дегидрогеназы, участвующие в дыхании клеток, активировали и сняли водород с дыхательного материала, а затем передали его на метиленовую синь, которая восстановилась и обесцветилась. Если с обесцвеченных семян слить воду, то на воздухе они снова синеют, так как лейкоформа метиленовой сини окисляется. Семена в контрольной пробирке остаются синими, поскольку при кипячении дегидрогеназы разрушились.