Итак, после выхода из транс-сети АГ часть везикул направляется к плазматической мембране, завершая путь из клетки во внеклеточное пространство. Как уже упоминалось, сливающиеся с мембраной пузырьки отнюдь не всегда выделяют секретируемые вещества. Часто основной задачей таких экзоцитозных пузырьков является доставка липидных или белковых компонентов в плазматическую мембрану, где они и будут в дальнейшем работать (например, ионные каналы, транспортеры, сигнальные рецепторы). Различают экзоцитоз регулируемый (инициируемый при действии какого-нибудь гормона или изменении ионного гомеостаза) и конститутивный. Конститутивный экзоцитоз может осуществляться пузырьками, не содержащими груза, и грузом в этом случае являются сами липиды мембраны. Этот механизм используется для замены «отработавших» компонентов мембраны или для быстрого увеличения поверхности мембраны в области активного края ламеллы, например, при движении клетки. Хотя в этом случае также используется термин «конститутивный экзоцитоз», он, очевидно, не является нерегулируемым процессом.
Рис. 6. Биосинтетический и секреторный, или экзоцитозный,
путь
На экзоцитозный путь вступают разные типы везикул (рис. 6).
Экзоцитозные пузырьки, основное назначение которых – доставлять к плазматической мембране липиды или белки, необходимые для функционирования самой клетки, как правило, имеют правильную форму и небольшие размеры (100–200 нм). Секреторные гранулы, содержащие плотно упакованные белки, предназначенные для секреции во внешнюю среду, имеют относительно большие размеры (200–500 нм) и неправильную форму, направляются к плазматической мембране по микротрубочкам, и взаимодействуют с мембраной только при координированном повышении уровня ионов кальция в подмембранном слое. Кальций-зависимое взаимодействие с мембраной демонстрируют и содержащие нейротрансмиттеры мелкие синаптические везикулы.
Мембраны экзоцитозных везикул могут сливаться полностью с плазматической мембраной, а могут и осуществлять кратковременое взаимодействие, при котором происходит так называемое «полуслияние» (semi-fusion), когда между пузырьком и плазматической мембраной образуется канал, через который выбрасывается часть содержимого везикулы. После этого канал замыкается, и везикула отсоединяется от ПМ. Процесс секреции подразумевает оба типа слияния. Этот механизм в англоязычной литературе получил название «kiss-and-run». Судя по всему, он реализуется не только в случае ограниченной секреции, но и при синаптической передаче и при взаимодействии поздних эндосом с лизосомами и в ряде других случаев.
2.2. ЭНДОЦИТОЗНЫЙ ПУТЬ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
2.2.1. Пути входа макромолекул в клетку
Эндоцитозный путь начинается на плазматической мембране. Поскольку через этот путь осуществляется контакт клетки с внешней средой, макромолекулярное содержимое которой весьма разнообразно, механизмы эндоцитоза выполняют в некотором роде барьерные функции, в задачу которых входит распознавание природы внеклеточных макромолекул. Этот первоначальный «фейс-контроль» кандидатов на вход в клетку реализуется за счет существования несколько путей входа, или порталов, через которые в клетку проникают разные типы макромолекул. Хотя существуют и способы проникновения, не опосредуемые формированием эндосом (образование пор, перенос через мембрану с помощью транспортеров), основная масса внеклеточных макромолекул использует механизмы везикулярного транспорта, поскольку они тесно связаны с механизмами сортировки.
Характерной чертой разных порталов являются их строго определенные размеры и, в ряде случаев, связь с дальнейшей судьбой груза (рис. 7).
Пиноцитоз – это путь, через который в клетку попадают в основном белки жидкой фазы, поэтому он часто называется жидкофазным эндоцитозом (f luid- p hase e ndocytosis, FPE). На самом деле, белки и другие компоненты жидкой фазы попадают во все формирующиеся на плазматической мембране инвагинации, но исключительность пиноцитоза в том, что никакие известные ныне мембранные белки не используют специфически этот путь для попадания в клетку. Пиносомы имеют около 90 нм в диаметре и образуются во всех клетках постоянно (но с разной скоростью). Если добавить в культуральную жидкость какой-нибудь флуоресцентно-меченый белок, например, бычий сывороточный альбумин (БСА), то его содержание в клетке будет увеличиваться медленно и относительно линейно, отражая баланс между интернализованным и рециклировавшим грузом. Более 90 % материала, попавшего в пиносомы, бысро рециклирует. Это говорит о том, что пиноцитоз в основном поддерживает гомеостаз поверхностной мембраны. Следует учитывать, что клетки различного тканевого происхождения имеют специфический набор рецепторов. Если эпителий легкого будет поглощать БСА пиноцитозом, то в клетках эпителия почечных канальцев существуют специализированные рецепторы для этого белка, который в этом случае пойдет внутрь клетки через так называемый рецептор-опосредованный эндоцитоз (РОЭ или r eceptor- m ediated e ndocytosis, RME).
Рис. 7. Пути входа макромолекул в клетку, их специфичность и последующая судьба эндосом разных типов
РОЭ еще называют клатрин-зависимым, поскольку в формировании эндосом в этом случае участвует мультимерный белок клатрин (clathrin). Такие эндосомы имеют диаметр около 120 нм. Само название говорит о том, что этот путь используют белки, имеющие высокоселективные мембранные рецепторы. Через него поступают как лиганды так называемых метаболических рецепторов (которые клетка использует в «питательно-строительных» целях), так и рецепторы пептидных гормонов и ростовых факторов различных классов. Комплексы лигандов с метаболическими рецепторами диссоциируют в ранних эндосомах, при этом рецепторы рециклируют, а лиганды идут на деградацию в лизосомах. В случае рецепторов второй группы, играющих сигнальную роль, и лиганд, и рецептор, как правило, деградируют, хотя возможен и выбор в пользу рециклирования. Ряд токсинов и вирусов также способны использовать этот путь.
Характерной чертой клатрин-зависимого пути входа является сложный механизм формирования инвагинации и селектирования в него груза, а также высокая эффективность интернализации, имеющая тенденцию к насыщению, поскольку количество рецепторов на мембране ограничено.
Разновидностью рецептор-опосредованного эндоцитоза является фагоцитоз, который осуществляется в основном специализированными клетками и характерен тем, что этим способом клетки поглощают крупные частицы (например, бактерии). В общем случае, «конечной целью» фагоцитирующей клетки является доставка бактерии, уже поврежденной в эндосомах в результате окислительного взрыва, в лизосомы и ее деградация.
Одним из побочных ранних действий ростовых факторов является стимуляция так называемого раффления. Раффлы (raffles) – динамичные искривления мембраны, похожие на воланы, или кораллы. Очевидно, что при контакте «вершин» этих выростов мембраны могут сливаться, и тогда довольно крупные неправильной формы замкнутые фрагменты мембраны окажутся внутри клетки. Такой процесс называют макропиноцитозом, хотя до сих пор неясно, является ли макропиноцитоз самостоятельным путем поступления веществ в клетку, или, как уже говорилось, это побочный эффект раффления. Известно, однако, что образование макропиносом (до десятка на клетку) зависит от активности фосфатилиинозитол-3-киназы р85 и Src-киназы. Кроме того, показано, что вирусы иммунодефицита HIV предпочитают именно макропиносомы для проникновения в клетку.
С течением времени макропиносомы приобретают более правильную форму и затем сливаются с лизосомами.
Еще одним путем входа, относительно которого до сих пор ведется оживленная дискуссия (ее детали будут обсуждены в следующих частях), является путь через кавеолы (caveolae, или «пещерки») – флаконообразные инвагинации, существующие только в клетках некоторых типов и являющиеся примером специализированных мембранных доменов, названных рафтами (от англ. raft, что означает «плотик»). Небольшая доля кавеол способна замыкаться, отрываться от мембраны и образовывать так называемые кавеосомы. Везикулярные кавеосомы могут содержать вирусы, которые затем отсортировываются в тубулярную часть кавеосомы, отпочковываются от нее и доставляются в ЭПР, тогда как обогащенная холестерином везикулярная часть кавеосомы направляется к аппарату Гольджи.
2.2.2. Основные компартменты эндоцитозного пути.
Ранние, рециклирующие и поздние эндосомы. Мультивезикулярные тела (МВТ). Лизосомы
Процесс формирования и отпочковывания от плазматической мембраны пузырька с грузом, в результате чего этот пузырек начинает свою самостоятельную жизнь в цитоплазме клетки, называется интернализацией. Судьба такого пузырька может быть различной и определяется рядом факторов, однако ключевыми являются природа груза и портал, использованный для входа. Основными компартментами эндоцитозного пути являются эндосомы, которые делятся на так называемые ранние и поздние (по времени появления в них интернализованных грузов), а также рециклирующие.
Как описывалось выше, несмотря на легкость визуальной идентификации основных компартментов биосинтетического пути, в вопросах его функционирования еще остается много неясного. В еще большей степени это относится к противоположному, эндоцитозному пути. Уже само название его главных компартментов ― «ранних» и «поздних» эндосом, основано не на каких-то характерных морфологических особенностях или локализации, а на времени попадания в них интернализованных белков-грузов, хотя и этот показатель весьма относителен. Так, в ранних эндосомах грузы выявляются уже через 5–20 мин после начала эндоцитоза, а в поздних могут обнаруживаться через 15–60 мин. Уже из приводимых цифр видно, что даже временн ы е границы существования ранних и поздних эндосом неопределенны. Строго выполняется лишь одно условие – в поздние эндосомы интернализованный груз попадает из ранних.
Первоначально ранние эндосомы описывали как гетерогенную популяцию пузырьков, представленную отдельными везикулами диаметром до 200 нм, тубуло-везикулярными структурами (т. е. структурами, в которых от основной везикулярной части вытягиваются недлинные «рукоподобные» (arm-like) тубулярные выросты), а иногда – как довольно протяженную тубуло-везикулярную сеть. Кроме того, эндоцитированные грузы часто выявляли в так называемых мультивезикулярных телах, или эндосомах (МВТ, МВЭ) – крупных, диаметром до нескольких микрон, образованиях, содержащих разное количество внутренних пузырьков диаметром 50–100 нм. Их место и роль в эндоцитозном пути оставалась долго неясной, хотя эти структуры встречаются во всех клетках от дрожжей до млекопитающих. Даже конечный пункт деградационного пути – лизосомы, выглядящие как обычные везикулы, не вносили дополнительной ясности в определение границ компартментов и в механизмы переноса грузов между ними.