Теперь, когда достаточно точное измерение ПП в отдельной клетке не представляло проблемы для проверки мембранной теории по формуле Нернста, оставалось сделать последний шаг — научиться так же точно определять ионный состав в клетке. И замечательно, что развитие микроэлектродной техники помогло решить и эту задачу.
Дело в том, что изготовление микроэлектродов — это целое искусство: и стекло подобрать, чтобы хорошо тянулось, и режим нагрева и скорость вытягивания, чтобы копчик не обламывался и внутренний канал не закупоривал, и т. д. и т. п. И вдруг оказалось, что даже если в опыте использовался плохой, «бракованный» электрод, у которого на кончике вообще не было отверстия, потенциал все равно регистрировался, как будто стекло было не изолятором, а проводником. Когда стали в этом разбираться, оказалось, что, действительно, тоненькие стенки микроэлектродов из некоторых сортов стекла представляют собой — что бы вы думали? — полупроницаемую мембрану, т. е. избирательно пропускают ионы какого-либо сорта.
Если такой электрод, заполненный раствором с известной концентрацией изучаемого иона, опустить в раствор, содержащий тот же ион, то, зная значение возникшего нернстовского потенциала, можно использовать формулу Нернста для решения обратной задачи — определить неизвестную концентрацию иона в исследуемом растворе.
Использование таких электродов в сочетании с методом меченых атомов и другими методами позволило определить ионный состав внутриклеточного содержимого. Оказалось, что, как и предсказывала мембранная теория, внутри клеток концентрация ионов калия в 30—40 раз выше, чем в наружной среде. Оказалось также, что соотношение калия и натрия внутри клеток животных совершенно иное, чем вне их: в то время как вне клетки много натрия, в клетках, наоборот, калия почти в 10 раз больше, чем натрия.
Высокое содержание ионов калия было обнаружено не только в нервных, но и в разных других клетках организма. Таким образом, внутреннее содержимое всех клеток животных оказалось непохожим на морскую воду. В ходе эволюции эти клетки создали свою особую внутреннюю среду.
Клеточная мембрана
Итак, вопросы об ионном составе внутренней и внешней среды, а также о величине ПП были решены; это косвенно доказывало и существование мембраны.
Увидеть мембрану удалось лишь в середине 50-х годов нашего века. Это было сделано с помощью электронного микроскопа, так как толщина мембраны составляет всего 7 —15 нм и в световой микроскоп ее увидеть нельзя. Однако еще до того, как ее непосредственно увидели, сомнения в ее существовании практически исчезли; многочисленные исследования, опирающиеся на факты из разных областей, свидетельствовали, что мембрана существует; более того, к этому времени было известно достаточно много об ее устройстве и свойствах: толщине, электрическом сопротивлении и т. д.
Обычно, говоря о научных предсказанниях, рассказывают об открытии «на кончике пера» планеты Нептун, или о предсказании существования атомов и молекул, или о предсказании Менделеевым химических элементов, которые заполнили оставшиеся пустыми соответствующие клетки его таблицы. Но и в биологии можно найти немало примеров таких научных предсказаний. Например, Гарвей, создавая теорию кровообращения, предсказал существование капилляров, но увидеть их смог только М. Мальпиги после изобретения микроскопа. Точно так же клеточная мембрана была предсказана задолго до появления электронного микроскопа.
Очень много сведений о свойствах мембраны дало изучение проникновения разных веществ в клетку. Это особый, весьма увлекательный и весьма запутанный рассказ, который мы не можем тут привести. Но общий вывод из него весьма поучителен. Дело в том, что, как сейчас выяснено, разные вещества попадают в клетку разными способами: одни, растворяясь в жирах мембраны, проникают в клетку прямо через них, другие вещества, которые не могут проходить через жиры, проникают через особые «поры», образованные мембранными белками, третьи — совсем иначе, например, «заглатываясь» клеткой, в которой образуется отшнуровывающийся и уходящий внутрь мембранный пузырек; и это еще не все способы. Между тем ученые стараются объяснить некоторое явление с единой точки зрения. Для науки идеалом является, например, теория Максвелла, которая позволила связать воедино электрические, магнитные и оптические явления, описав их основные свойства несколькими уравнениями. Такую же единую теорию искали и ученые, изучавшие клеточную проницаемость. Однако, как мы теперь понимаем, в случае клеточной проницаемости такой единой теории просто не существовало. При наличии многих принципиально различных способов проникновения веществ в клетку для каждой теории, претендующей на полное объяснение фактов с единой точки зрения, находился опровергающий ее эксперимент. Мы все сталкивались с аналогичной ситуацией; вспомните, как Вольта пытался объяснить с единой точки зрения и контактную разность потенциалов, и работу химических элементов. Так, естественное стремление ученого к созданию единой теории иногда играет роль тормоза в развитии науки. Но вернемся к мембране.
Поверхность всякого организма играет особую роль, так как это — место соприкосновения организма и среды. Именно на поверхности находится защитный слой; на поверхности находятся органы чувств; через поверхность организм получает воду, пищу и кислород. Все эти соображения применимы и к отдельной клетке. Через поверхностную мембрану клетка получает разные вещества, через нее же выводятся наружу продукты обмена. В мембрану встроены особые белки-рецепторы — «органы чувств» клетки. Но мембрана покрывает не только поверхность клетки, внутри клетки тоже имеется множество мембран, которые делят клетку на отсеки, окружают ее органеллы. Особой двухслойной ядерной мембраной окружено ядро клетки, свою мембрану имеют «энергетические станции клетки» — митохондрии. В пузырьках из мембран — лизосомах — хранятся некоторые клеточные ферменты и т. д.
Про мембраны теперь известно так много, что возникла особая наука — мембранология; в нашей стране выходит специальный журнал «Биологические мембраны», а за рубежом журнал «Биология мембран». Для подробного рассказа о мембранах нужно было бы написать отдельную книгу. Такие книги уже написаны, поэтому мы расскажем здесь о мембранах лишь то, что будет нам совершенно необходимо для дальнейшего.
Клеточная мембрана представляет собой жидкую пленку, образованную жироподобными веществами — липидами. Она состоит из двух слоев липидных молекул, в которые встроены молекулы белка.
Нас, прежде всего, будут интересовать, конечно, электрические характеристики мембраны, которые были определены с помощью самых разных методов. Эта работа была начата еще в 1910 г. в лаборатории Нернста и в ней принимал участие тот самый Гебер, который открыл влияние солей калия на потенциал мышц. Измерения проводились на суспензии клеток. Основной метод измерения состоял в том, что через суспензию пропускали ток разной частоты и определяли ее удельное сопротивление. Была развита теория, которая позволяла отдельно определить сопротивления мембраны клетки и ее протоплазмы, так как их отношение зависело от частоты пропускаемого тока.
Развивая это направление, Г. Фрикке в 1925 г. показал, что мембрана ведет себя в опытах как параллельно соединенные сопротивление и емкость, т. е., как говорят, выяснил эквивалентную схему мембраны. Схема эта первоначально была установлена Для мембраны эритроцитов; Фрикке использовал при измерениях частоты до 4,5 МГц, так что успеху его работы способствовало развитие физических приборов — появление генераторов высокой частоты. В дальнейшем на самых разных клетках удалось измерить сопротивление мембраны, ее емкость, а также удельное сопротивление протоплазмы. Г. Фрикке и Г. Кертис работали с эритроцитами, лейкоцитами, одноклеточной водорослью — хлореллой, дрожжами; К. Кол работал с яйцеклетками иглокожих, мышечными и нервными клетками.
Оказалось, что удельная емкость мембраны у всех изученных клеток составляет примерно 1 мкФ/см2. Не слишком сильно отличается у разных клеток и удельное сопротивление протоплазмы, оно обычно близко к 100 Ом-см, т. е. примерно такое же, как у морской воды. Напротив, удельное сопротивление мембраны у разных клеток оказалось весьма разным! Так, например, у яйцеклеток морского ежа удельное сопротивление мембраны составляет всего 100 Ом-см2, а у водоросли нигеллы — 100 000 Ом-см2 *).
Почему же у разных клеток мембрана имеет одинаковую удельную емкость и столь разное удельное сопротивление? Дело в том, что емкость мембраны определяется ее липидным слоем, который можно рассматривать как диэлектрик, находящийся между двумя пластинами конденсатора.
А вот сопротивление мембраны определяется не липидами, а теми молекулами белка, которые встроены в жидкий липидный слой и плавают в нем, как айсберги, «прошивая» мембрану насквозь. Эти молекулы в разных клетках отличаются и по числу, и по свойствам — отсюда и разное удельное сопротивление. Если убрать из липидного бислоя белок, то удельное сопротивление такой «чистой» мембраны оказывается весьма высоким — порядка 108 Ом-см2.
С помощью изотопных и других методов было показано, что клеточная мембрана действительно является полупроницаемой: она хорошо пропускает положительные ионы калия, но не пропускает клеточные анионы. Но вернемся к мембранной теории.