Компетентная клетка (competent cell)

Компетентная клетка (competent cell) [лат. competens — соответствующий, способный] — 1) клетка, способная воспринимать индуцирующее воздействие и специфически реагировать на него изменением, проявляющемся в дальнейшем развитии; 2) физиологическое состояние клетки, определяющее ее способность принимать извне экзогенную ДНК; напр., состояние бактерии, при котором она может включать в себя экзогенные молекулы ДНК, т. е. быть реципиентом ДНК при трансфекции (см. Трансфекция). Искусственно полученные К.к. широко используются в генной инженерии (см. Генетическая (генная) инженерия) в качестве реципиентов рекомбинантных плазмид.

Компетентность клетки

Среды. Как они готовятся

Какие среды бывают для прокариот и эукариот

Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами В основе большиства методов трансформации бактерий лежат данные о том, что обработка бактерий на холоду раствором хлористого кальция и последующее кратковременное нагревание индуцируют у них временное состояние «компетентности», когда они могут поглошать из раствора чужеродную ДНК. Компетентные клетки Е. coli можно либо приобрести у коммерческих фирм (BRL, Gaithersburg, Maryland, USA), либо получить в лаборатории и использовать их немедленно или заморозить. Коммерческие препараты компетентных клеток обладают высоким качеством и позволяют получить частоту трансформации более 108 колоний на 1 мкг сверхспиральной плазмидной ДНК. Однако эти препараты очень дороги. В протоколе описан метод получения компетентных бактериальных клеток, обеспечивающий частоту трансформации ~107 трансформированных колоний на 1 мкг плазмидной ДНК. Он идеально подходит для таких бактериальных штаммов, как JM109, НВ101, TG1 и TG2, но с его помощью можно трансформировать примерно с такой же частотой практически любой бактериальный штамм. Такая эффективность трансформации достаточно высока для осуществления всех рутинных операций клонирования в плаз-мидах, однако, например, для получения плазмидных библиотек кДНК, синтезированных на редких мРНК, нужна более высокая частота трансформации и необходимы альтернативные методы. Метод, описанный в работе, позволяет получать компетентные культуры клеток Е. coli штаммов DH1, DH5 и ММ294, для которых частота трансформации достигает 7,5 • 108 колоний на 1 мкг сверхспиральной плазмидной ДНК. Более высокую частоту (109—1010) можно получить только с помощью электропорации. Этот метод разрабатывался для введения ДНК в клетки эукариот, но недавно его использовали и для трансформации Е. colt. Необходимые для электропорации специальный высоковольтный мини-электрод и кювета для образца вместе с детальным описанием процедуры трансформации поставляются фирмой Bio-Rad. Успешное получение компетентных клеток с помощью описанного в протоколе метода зависит от нескольких факторов. Особое внимание следует обратить на: а) плотность культуры бактериальных клеток; б) поддержание во время всех процедур температуры на уровне 0-4 С. Получение компетентных клеток Е. coli обработкой хлористым кальцием Материалы • 0,1 М СаС12 • Диметилсульфоксид (ДМСО) • Среда LB: 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl растворяют в 1 л деионизованной воды и доводят рН до 7,0 с помощью 5 М NaOH. Стерилизуют автоклавированием в жидком цикле. • Для получения LB-arapa на 1 л среды добавляют 15 г агара Difco и стерилизуют автоклавированием, как описано выше. • Среда SOB: 20 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г NaCl растворяют в 950 мл деионизованной воды, добавляют 10 мл 250 мМ НС1, доводят рН до 7,0 с помощью 5 М NaOH и доводят объем до 1 л. Стерилизуют, как описано выше. • Среда SOC: идентична среде SOB за исключением того, что содержит также 20 мМ глюкозу. После автоклавирования среды SOB ее охлаждают и добавляют 20 мл 1 М стерилизованной фильтрацией глюкозы. Методика 1. Снимают одиночную бактериальную колонию с чашки с LB-агаром, инкубированной при 37 'С в течение 16—20 ч, и переносят ее в 10 мл LB-среды в пробирке на 20 мл. Инкубируют при 37 °С и сильной аэрации (200 об/мин на круговом шейкере) в течение ночи. 2. 1 мл полученной ночной культуры вносят в 100 мл среды LB, налитой в колбу на 1 л, и инкубируют ее при 37 °С и сильной аэрации (200 об/мин на круговом шейкере) в течение примерно 2 ч до достижения плотности ~108 клетка/мл (ОД600 ~ 0,4). 3. Переносят культуру в стерильные охлажденные центрифужные пробирки на 50 мл (Falcon 2070) и охлаждают до 0 С инкубацией во льду в течение 10 мин. 4. Собирают клетки центрифугированием (ротор Sorvall GS3 или аналогичный) при 4300 g в течение 5 мин при 4 С. 5. Сливают надосадок и переворачивают пробирку на 1 мин для полного его стекания. 6. Ресуспендируют клеточный осадок в 10 мл ледяного 0,1 М СаСl2 при осторожном встряхивании и инкубируют клетки во льду в течение 30 мин. 7. Собирают клетки центрифугированием (ротор GS3 или аналогичный) при 4300 g в течение 5 мин при 4 С. 8. Сливают супернатант и переворачивают пробирку на 1 мин, с тем чтобы супернатант полностью стек. 9. Ресуспендируют каждый осадок в ледяном 0,1 М СаСl2(из расчета 2 мл на 50 мл исходного объема культуры). До использования суспензию лучше оставить на 1 ч при 4 С; при 4 °С ее можно хранить до 48 ч (но после 24 ч хранения эффективность трансформации будет снижаться). Суспензию можно разлить на аликвоты и хранить при -70 С. 10. С помощью охлажденного стерильного наконечника для микропипетки переносят по 200 мл каждой суспензии в стерильную полипропиленовую пробирку (Falcon 2059 17 х 100 мм). Добавляют сверхспиральную плазмидную ДНК (не более 50 нг в объеме не более 10 мкл), осторожно перемешивают и 30 мин инкубируют во льду. Контроли • Компетентные клетки, к которым добавлено известное количество (от 1 до 20 нг) сверхспиральной плазмидной ДНК. • Компетентные клетки, к которым плазмидная ДНК не добавлялась. 11. Переносят пробирки ровно на 90 с в водяную баню на 42 °С, Пробирки при этом не встряхивают. 12. Быстро переносят пробирки обратно в лед и инкубируют 2 мин. 13. Добавляют в каждую пробирку 800 мкл среды SOC и для индукции экспрессии кодируемого плазмидой маркера устойчивости к антибиотикам инкубируют их при умеренной аэрации (100 об/мин) в течение 45 мин при 37 С. 14. Переносят до 200 мкл трансформированных компетентных клеток в содержащие соответствующий антибиотик чашки Петри диаметром 90 мм с LB- или SOB-средой. Равномерно распределяют трансформированные клетки по поверхности агара стерильной изогнутой стеклянной палочкой. 15. Оставляют чашки при комнатной температуре до подсыхания. 16. Переворачивают чашки и инкубируют их при 37 С. Колонии становятся видимыми через 12-16 ч. - Добавляют к 2 мл ресуспендированных клеток 70 мкл ДМСО, аккуратно перемешивают и помещают суспензию на 15 мин в лед. - Добавляют к каждой суспензии еще 70 мкл ДМСО, опять аккуратно перемешивают и помещают суспензию в лед. - Быстро разливают суспензию порциями по 50 мкл в охлажденные стерильные микроцентрифужные пробирки и замораживают компетентные клетки в жидком азоте. До использования хранят пробирки при - 70 С. - При необходимости суспензию размораживают, подержав пробирку в руках, и помещают в лед как минимум на 10 мин.

Источник: https://medicalplanet.su/genetica/329.html MedicalPlanet

Среды SOB и SOC
для получения компетентных клеток бактерий

Среды SOB (Super Optimal Broth)и SOC (Super Optimal broth with Catabolic repressor)богаты питательными веществами и применяются для выращивания компетентных клеток с последующей трансформацией; триптон обеспечивает азотом и углеродом, необходимыми для роста; дрожжевой экстракт является источником витаминов, в частности, группы В; ионы натрия и калия поддерживают необходимый осмос; сульфат магния является источником ионов магния, необходимых для работы бактериальных ферментов; глюкоза, входящая в состав среды SOC поставляет необходимый энергетический ресурс для восстановления клеток после трансформации и для репликации; в состав среды SOB глюкоза не входит. Расход: среда SOB - 28 г на 1 л; cреда SOC - 30 г на 1 л.

	# 3132.0250	Среда SOB		г	Диаэм	23,04 евро   Склад: да
	# 3132.0500	Среда SOB		г	Диаэм	44,00 евро
	# 244310	Среда SOB Medium, Difco		г	BD	по запросу
	# 3133.0250	Среда SOC		г	Диаэм	21,00 евро
	# 3133.0500	Среда SOC		г	Диаэм	40,09 евро

Среды LB по Lennox и LB по Miller
для рутинного культивирования, для рекомбинантных штаммов E.coli

Среды LB (Lisogenic Broth)используются для стандартных манипуляций с E.coli; LB по Miller содержит 1% NaCl, LB по Lennox содержит 0,5% NaCl, среды с низкой концентрацией солей - для выращивания культур с солечувствительными антибиотиками; входящий в состав среды триптон служит источником азота и углерода; дрожжевой экстракт является источником витаминов, в частности, группы B и других метаболитов.

Расход: агар LB по Lennox - 35 г на 1 л; бульон LB по Lennox - 20 г на 1 л; агар LB по Miller - 40 г на 1 л; бульон LB по Miller - 25 г на 1 л.

	# 3134.0250	Бульон LB по Lennox		г	Диаэм	19,91 евро   Склад: да
	# 3134.0500	Бульон LB по Lennox		г	Диаэм	36,10 евро
	# 240230	Бульон LB по Lennox, Difco		г	BD	286,00 евро
	# 240210	Бульон LB по Lennox, Difco		кг	BD	по запросу
	# 3230	Бульон LB по Lennox в капсулах, (1 кап. содержит 1г на 50 мл среды)		г	Диаэм	199,90 доллар
	# 3135.0250	Бульон LB по Lennox с соевым пептоном		г	Диаэм	22,92 евро   Склад: да
	# 3135.0500	Бульон LB по Lennox с соевым пептоном		г	Диаэм	43,76 евро

	# 3139.0250	Агар LB по Lennox		г	Диаэм	24,00 евро   Склад: да
	# 3139.0500	Агар LB по Lennox		г	Диаэм	45,00 евро   Склад: да
	# 240110	Агар LB по Lennox, Difco		г	BD	по запросу
	# 3229	Агар LB по Lennox в капсулах, (1 кап. содержит 5 г на 150 мл среды)		г	Диаэм	281,90 евро
	# 3136.0250	Агар LB по Lennox с ампициллином, 100 мкг/мл		г	Диаэм	33,99 евро   Склад: да
	# 3136.0500	Агар LB по Lennox с ампициллином, 100 мкг/мл		г	Диаэм	63,00 евро   Склад: да
	# 3137.0250	Агар LB по Lennox с канамицином, 50 мкг/мл		г	Диаэм	54,00 евро   Склад: да
	# 3137.0500	Агар LB по Lennox с канамицином, 50 мкг/мл		г	Диаэм	103,00 евро
	# 3138.0250	Агар LB по Lennox с соевым пептоном		г	Диаэм	28,00 евро   Склад: да
	# 3138.0500	Агар LB по Lennox с соевым пептоном		г	Диаэм	52,00 евро
	# 3140.0250	Агар LB по Miller		г	Диаэм	20,60 евро   Склад: да
	# 3140.0500	Агар LB по Miller		г	Диаэм	40,17 евро
	# 244520	Агар LB по Miller, Difco		г	BD	242,00 евро
	# 244510	Агар LB по Miller, Difco		кг	BD	по запросу
	# 3227	Агар LB по Miller в капсулах, (1 кап. содержит 10 г на 250 мл среды)		г	Диаэм	107,00 евро   Склад: да
	# 3141.0250	Бульон L по Miller		г	Диаэм	28,32 евро   Склад: да
	# 3141.0500	Бульон L по Miller		г	Диаэм	54,07 евро   Склад: да
	# 244620	Бульон LB по Miller, Difco		г	BD	по запросу
	# 244610	Бульон LB по Miller, Difco		кг	BD	по запросу
	# 3228	Бульон LB по Miller в капсулах, (1 кап. содержит 12,5 г на 500 мл среды)		г	Диаэм	125,00 евро   Склад: да
	# 3142.0250	Агар LB по Miller с ампициллином, 50 мкг/мл		г	Диаэм	29,40 евро   Склад: да
	# 3142.0500	Агар LB по Miller с ампициллином, 50 мкг/мл		г	Диаэм	56,00 евро
	# 3143.0250	Агар LB по Miller с ампициллином, 100 мкг/мл		г	Диаэм	29,00 евро
	# 3143.0500	Агар LB по Miller с ампициллином, 100 мкг/мл		г	Диаэм	55,00 евро
	# 3144.0250	Агар LB по Miller с канамицином, 50 мкг/мл		г	Диаэм	48,30 евро   Склад: да
	# 3144.0500	Агар LB по Miller с канамицином, 50 мкг/мл		г	Диаэм	92,00 евро
	# 3145.0250	Агар LB по Miller с хлорамфениколом, 34 мкг/мл		г	Диаэм	26,30 евро   Склад: да
	# 3145.0500	Агар LB по Miller с хлорамфениколом, 34 мкг/мл		г	Диаэм	50,00 евро

Среды Terrific
для выращивания трансформированных бактерий-продуцентов белка

Среды Terrificбогаты питательными веществами, необходимыми в логарифмической фазе роста рекомбинантных клеток E. coli; повышенное содержание триптона и дрожжевого экстракта в среде обеспечивают высокую плотность E.coli при нормальной аэрации; глицерин служит дополнительным источником энергии; фосфаты калия выполняют функцию буферных соединений для предотвращения снижения рН среды во время роста бактерий; применяется как альтернатива бульону LB при экспрессии рекомбинантных белков и наращивании плазмидной ДНК. Расход: бульон Terrific - 50 г на 1 л; среда на основе бульона Terrific с добавлением лактозы и глюкозы - 55 г на 1 л.

	# 3146.0250	Бульон Terrific, повышенная экспрессия белков и выход плазмид		г	Диаэм	19,51 евро   Склад: да
	# 3146.0500	Бульон Terrific, повышенная экспрессия белков и выход плазмид		г	Диаэм	37,25 евро   Склад: да
	# 243820	Бульон Terrific, повышенный выход плазмид, Difco		г	BD	по запросу
	# 243810	Бульон Terrific, повышенный выход плазмид, Difco		кг	BD	по запросу
	# 3147.0250	Среда на основе бульона Terrific с добавлением лактозы и глюкозы		г	Диаэм	25,29 евро   Склад: да
	# 3147.0500	Среда индукционная на основе бульона Terrific с добавлением лактозы и глюкозы		г	Диаэм	48,28 евро

Cреды YPD
для культивирования дрожжей

Среды YPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose) применяются для культивирования дрожжей S.cerevisiae; богаты питательными веществами, витаминами, солями; повышенное содержание пептона и дрожжевого экстракта способствует быстрому росту биомассы; декстроза служит дополнительным источником углеводов.

Расход: агар YPD - 65 г на 1 л; бульон YPD - 50 г на 1 л.

	# 3148.0250	Агар YPD для культивирования дрожжей, с декстрозой		г	Диаэм	28,00 евро
	# 3148.0500	Агар YPD для культивирования дрожжей, с декстрозой		г	Диаэм	53,00 евро   Склад: да
	# 242720	Агар YPD для культивирования дрожжей, с декстрозой, Difco		г	BD	по запросу
	# 242820	Бульон YPD для культивирования дрожжей, с декстрозой, Difco		г	BD	по запросу
	# 242810	Бульон YPD для культивирования дрожжей, с декстрозой, Difco		кг	BD	по запросу

Среды NZCYM и 2хYT
для размножения E.coli и бактериофагов

Среды NZCYM (NZamine-Casaminoacid-YeastExtract-Magnesiumsulfate) для культивирования рекомбинантных штаммов E.coli и размножения фага лямбда; в состав сред входят панкреатический гидролизат казеина, казаминовые кислоты, витамины и другие необходимые метаболиты, обеспечивающие быстрый рост биомассы; сульфат магния, входящий в состав среды служит источником ионов магния, способствующих протеканию различных ферментативных процессов в клетке, включающих репликацию ДНК. Расход: 22 г на 1 л.

	# 3149.0250	Бульон NZCYM для культивирования E.coli и фагов		г	Диаэм	32,86 евро   Склад: да
	# 3149.0500	Бульон NZCYM для культивирования E.coli и фагов		г	Диаэм	62,73 евро
	# 240410	Бульон NZCYM для культивирования E.coli и фагов, Difco		г	BD	по запросу

Среды 2хYT (2хYeastextractand Tryptone) для роста рекомбинантной E.coli и размножения бактериофага 13М; богаты азотом и ростовыми факторами, что позволяет получать высокий титр фага без использования клетки-хозяина; входящие в состав аминокислоты и витамины способствуют быстрому росту рекомбинантных штаммов E.coli. Расход: 31 г на 1 л.