по направлению 06.03.01– «Биология»
студентки 4 года обучения по профилю
«Биохимия»
Османовой Патимат Магомедмухтаровны
«ВЛИЯНИЕ ТЕЛЛУРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ»
Научный руководитель:
к.б.н., доцент
_____________ А.М.Джафарова
Работа допущена к защите:
Зав. кафедрой биохимии и биофизики,
к.б.н., доцент
_____________ Р.А. Халилов
Нормоконтролер:
_____________ И.Х. Гаджиева
«____» ____________ 2019 г.
Махачкала – 2020
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР …………………………………………
1.1. Общая характеристика теллурорганических соединений. Биологический эффект………………………………………………………….
1.2. Общая характеристика активных форм кислорода и азота. Механизмы индукции…………………………………………………………..
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫИ МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ ………………..
2.1. Объекты исследвания
2.2. Препаративные методы исследования
2.3. Биохимические методы исследования
2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика теллурорганических соединений. Биологический эффект
Теллурорганические соединения содержат связь Te – C. Самыми важными и часто применяемыми как в практическом, так и в теоретическом отношении являются: теллуролы, теллуроксиды, теллуральдегиды, теллуриды и дителлуриды, теллуриновые кислоты и теллурониевые соли. По химическим свойствам органические соединения теллура близки к селенорганическим, но отличаются выраженным металическим характером теллура (Саадеков et al, 1987).
Несмотря на относительное обилие теллура в организме человека и животных, исследование биологических свойств органических соединений теллура ограничено в литературе.
Одним из важнейших свойств теллурорганических соединений является их антиоксидантная активность. Особенностью является большая антиоксидантная активность производных теллура, по сравнению с аналогами серы и селена. Антиоксидантная активность органических соединений теллура носит автокаталитический характер. Это объясняется например тем, что диарилтеллуриды ингибируют перикисное окисление липидоав, дольше, чем обычные антиоксиданты (Rodrigo, 2008). Некоторые антиоксидантные теллурорганические соединения структурно связаные с витамином Е, способны ингибировать систему тиоредоксин /тиоредоксинредуктаза (TrxR) и рост раковых клеток (Engman et al. 2003). Система TrxR является многообещающей окислительно-восстановительной мишенью для терапии рака (Urig and Becker 2006).
Другим классом органотеллуриевых соединений, проявляющих антиоксидантную активность, являются диоргано-дителлуриды, которые содержат в своей структуре координирующие азотные группы и демонстрируют сильное вторичное взаимодействие между теллуром и атомами азота.
Помимо структурно простых соединений теллура, были описаны и более сложные теллурорганические соединения, проявляюшие антиоксидантную активность: полусинтетический теллуросубтилизин, дендримерные органотеллуриды и полимерные поверхностно активные вещества на основе теллура (Mao et al. 2005; Francavilla et al. 2001, Ahsan et al. 2003).
. Ранее считалось, что теллурорганические соединения являются менее токсичными, чем соединения селена, но последние данные указывают на обратное (Nogueira et al. 2004).
Токсикология соединений теллура изучалась в основном эмпирическими методами, основанными на относительной токсичности наблюдаемой у животных и оценке эффектов в тканях или ингибировании клеточного роста (Sailer et al. 2004). Известно, что при введении в избытке соединеий теллура в живой оранизм, происходит замещение теллуром серы в тиоловых группах, что приводит к ингибированию ферментов. Это доказывает токсическое действие теллура на живой организм (Попков et al, 2000).
В целях выяснения токсического воздействия теллурорганических соединений на показатели крови, был поставлен опыт на кроликах. Животным опытной группы вводилось 300 мг оксида теллура (IV) в сутки. За опытными и контрольными животными проводилось систематическое наблюдение. Исследовали мазки крови кроликов, выводили лейкограмму. У кроликов опытной группы отмечается уменьшение количества лейкоцитов — лейкопения, вызванная действием теллура. Происходит увеличение количества зрелых (палочкоядерных и сегментоядерных) форм псевдоэозинофилов на фоне лейкопении. Это может служить основанием для суждения о достаточно сильном воздействии раздражителя (теллурорганического соединения) на костный мозг, что приводит к функциональной недостаточности костномозгового кроветворения. Отмечается дегенеративный сдвиг ядра (Пономарев, 2006).
Органические производные теллура токсичны для центральной нервной системы грызунов (Maciel et al. 2000). Например диметилтеллурий дихлорид ингибирует очищенную сквален-монооксигеназу и ее действия в клетках, вызывая резкое снижение биосинтеза холестерина и демиелинизацию периферических нервов. Инактивация сквален монооксигеназы происходит в результате взаимодействия теллуранов и пары виоловых тиолов из каталитического цистеина в ферменте. Диметилтеллурий дихлорид является наиболее сильным ингибитором этого фермента, и его действие на нервные клетки очень похоже на то, что наблюдается при Te0 - индуцированной невропатии (Laden, 2001).
Теллурорганические соединения хорошо зарекомендовали себя как модели для изучения теоретических вопросов в органической химии и как важные в практическом отношении соединения. Широко используются в органическом синтезе в качестве интермедиатов и синтонов, а так же для изготовления различных батарей, пленок и покрытий. Некоторые соединения теллура используются в качестве медицинских препаратов (Petragnani, 2007).
. Органотеллуриевые соединения также нашли применение в фотодинамической терапии (ФДТ), разработаной в качестве альтернативной терапии рака. В основу этой терапии входит использование сенсибилизирующего агента (теллура), который способен взаимодействовать с продуцирующими свет цитотоксическими веществами или цитотоксической реакцией при опухолевой карциноме, обычно синглетного кислорода или супероксида от молекулярного кислорода (Leonard et al. 1999). Сенсибилизирующий агент обычно представляет собой порфирины, фталоцианины или красители, и в идеале он может оказывать предпочтительное взаимодействие с опухолевыми клетками.
В настоящее время, большую актуальность приобретает синтез новых антибактериалых препаратов, в связи с появлением большого количества штаммов бактерий, резистентных к воздействию антибиотиков широкого спектра. Наиболее перспективными в этом отношении являются органические соединения теллура. Например, гетероциклические производные дийодида дибензоилтеллура показали антибактериальную активность против грамположительных (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella typhi) бактерий. Теллуроорганические соединения, у которых атом теллура расположен у алифатического атома углерода, обладают лучшей активностью, чем соединения, имеющие атом теллура у ароматического кольца (Soni, 2007; Chasteen, 2009). Это, обусловлено легким разрывом связи «С-Те» у алифатического атома углерода и последующим освобождением атома теллура в виде неорганического теллурит-аниона, который значительно токсичнее своей органической формы (Meinerz, 2013; Садеков, 1995).
По сравнению с неорганическими теллуранами, органотеллураны имеет особое преимущество. Неорганические соединения теллура ограничены доступностью лиганда, органические могут быть получены путем окисления каждого соединения органотеллурия (II), которое может иметь множество структурных мотивов. Принимая это во внимание, небольшой набор органотеллуранов был оценен как ингибиторы рекомбинантного человеческого катепсина B (Cunha et al. 2005). Поэтому было отмечено, что органотеллураны являются мощными инактиваторами катепсина B. Инактивация катепсина В зависит от времени и концентрации и включает модификацию каталитического тиола фермента. Наиболее интересная особенность органотеллуранового ингибирования заключается в восстановлении активности фермента с использованием восстановителей, таких как дитиотреитол (DTT). Были проведены исследования стыковки с использованием этих и других органотеллуриевых соединений (Cunha et al. 2006).
Наконец, органотеллураны были изучены как ингибиторы протеазы. Первое описание этого эффекта было представлено для неорганических теллуранов (Albeck et al. 1998). В этом первом оригинальном сообщении изучались соединения теллура (IV), теллура (VI) и влияние на активность четырех основных классов протеаз. Было обнаружено, что только неорганические соединения теллура (IV) проявляли специфическую ингибирующую активность в отношении цистеиновых протеаз папаина и катепсина В из бычьей селезенки. Совсем недавно сообщалось, что неорганический теллуран, полученный из винной кислоты, названный SAS, также является более сильным ингибитором папаина и катепсина В (Yosef et al. 2007). Все эти соединения были ошибочно классифицированы как теллурорганические соединения, но, поскольку ни одно из них не обладает формальной углерод-теллурной связью, его следует правильно классифицировать как неорганические соединения теллура.
1.2. Общая характеристика активных форм кислорода и азота.
Механизмы индукции.
Активные формы кислорода (АФК), составляют отдельную систему в живых организмах, принимая участие как в ряде физиологических, так и патологических процессах (Донцов, 2006). Играют значительную роль в регуляции основных функций в клетке в норме и при воздействии на клетку различных патогенных факторов, выступая в роли индукторов адаптации или индукторов апоптоза. АФК способны разрушать клеточные структуры, а также инициировать процессы свободнорадикального окисления белков, липидов, нуклеиновых кислот, что и лежит в основе многих заболеваний (Новиков et al, 2015).
К активным формам кислорода, в настоящее время, относятся: супероксид радикал, гидроперекисный радикал, гидроксил радикал, перекись водорода, пероксинитрит, синглетный кислород, гипохлорит и окись азота (Гарифзянов et al, 2011: Новиков et al, 2015).
Дыхательная цепь митохондрий является основным источником АФК, за счет утечки электронов с I и III митохондриальных ферментных комплексов, в результате чего 2-5% поступающего кислорода переходит в активную форму (Гривенникова et al, 2013). Основным местом образования АФК в дыхательной цепи является убихинол цитохром C оксидоредуктаза, где генерация АФК происходит за счет восстановления молекулярного кислорода от убисемихинона (Chen, 2003).
Помимо митохондрий источниками АФК могут являться: пероксисомы, в которых локализован ряд ферментов, учавствующих в метаболизме перекиси водорода; гладкий эндоплазматический ретикулум, где расположены цитохром зависимые оксигеназы, продуцирующие супероксидный радикал; плазмалемма макрофагов и эпителиоцитов, где существует НАД (Ф) Н-оксидазная система, продуцирующая супероксид анион в ходе иммунного и воспалительного ответа (Новиков et al, 2015).
Ранее считалось что АФК являются исключительно токсичными метаболитами для клетки, однако по мере их изучения стало понятно, что они не всегда пагубно влияют на живой организм.
Активные формы кислорода участвуют во внутриклеточной сигнализации, способны изменять активность различных транскрипционных белков, могут выступать в качестве индукторов апоптоза или ингибировать цитотоксическое действие лекарственных препаратов на раковые клетки. (Судаков et al, 2006; Fluery et al, 2002).
Существуют данные об участии АФК в регуляции редокс – статуса клетки и окислительной модификации белков, результатом чего является активация ядерных факторов транскрипции, которые находятся в неактивном состоянии, пока в их молекуле не произойдет отщепление ингибиторного домена. После этого ядерные факторы транскрипции становятся способными индуцировать различные гены (Сезонтова et al, 2002; Сезонтова et al, 2005; Лукьянова, 2011).
При гипоксии происходит адаптация клетки к нехватке кислорода путем активации активными формами кислорода митохондриального АТФ – чувствительного калиевого канала, что приводит к слабому разобшению митохондрий, в результате чего происходит снижение мембранного потенциала. Даже незначительное снижение мембранного потенциала приводит к уменьшению продукции супероксид аниона (Новиков et al, 2014; Коршунов et al, 1997; Zhang, 2001).
Таким образом активные формы кислорода учавствуют в клеточной сигнализации и в адаптации клетки к гипоксии.
Повреждающее действие АФК оказывают прежде всего на митохондрии, несмотря на то, что они имеют систему защиты, включающую ферменты супероксиддесмутазу (супероксиддисмутазу (нейтрализация супероксид-аниона в перекись водорода), пероксидазу и глутатионпероксидазу (деградация перекиси водорода), а также глутатион, восстановленную форму коэнзима Q, аскорбиновую кислоту и другие низкомолекулярные антиоксиданты. Когда митохондрии перестают справляться с детоксикацией АФК, в клетке развивается окислительный стресс, который является причиной большинства дегенеративных заболеваний, старения и гибели клетки (Миронова, 2011; Судаков et al, 2006; Яснецов et al, 1994; Murphу, 2004).
Активные формы азота могут участвовать как в физиологических, так и в патологических процессах в живых организмах (Frein et al, 2005; Matarrese et al, 2005). К активным формам кислорода относятся: оксид азота, диоксид азота, пероксинитрит и др.
Образование АФА протекает по нескольким механизмам:
1) при участии конституциональной, индуцибельной и эндотелиальной NO – синтетазы
2) в результате нитритредуктазной активности гемсодержащих белков (Hb, миоглобина, цитохромоксидазы, цитохрома Р450)
3) при неферментативном превращении ионов NO2- при кислых значениях pH (Дерягина et al, 2019).
Активные формы азота способны реагировать с белками и липидами мембраны эритроцитов, изменяя ее форму, транспортные и механические свойства (Стародубцева et al, 2006). Часто бывает сложно определить роль той или иной АФА в этих процессах, так как в реакциях активных форм одного типа с молекулами, образуются новые типы активных форм азота (Стародубцева et al, 2003; Pryor et al, 1995).
Окислы азота нитраты и нитриты, участвующие в круговороте азота в биосфере, попадая в живые организмы в больших концентрациях, оказывают на них токсическое, мутагенное и иммуносупрессивное действие, вызывая тем самым различные хронические заболевания органов дыхательной системы (пневмосклероз, эмфизему, бронхоэктазы) (Lyon, 2010; Дерягина et al, 2003). После отравления окислами азота в крови образуются нитраты и нитриты, которые превращают гемоглобин в метгемоглобин. Нитриты способны восстанавливаться до оксида азота при участии ксантинооксидоредуктазы, а также в реакциях с гемоглобином, в результате чего образуются свободнорадикальные формы кислорода и азота, нитрозильный радикал, которые оказывают повреждающее действие на клеточные структуры (Дерягина et al, 2019).
Помимо токсического влияния, активные формы азота участвуют также в защите клеток, обладая антиоксидантными свойствами. NO способен перехватывать такие опасные радикалы, как O2-, OH-, RОО. NO ингибирует опосредуемые Fe3+ оксидативные реакции и тем самым проявляет антиоксидантное действие. Мишенями прямого действия NО являются Сu и Zn, входящие в состав SOD, и высокоэнергетические свободные радикалы (радикалы с углеродным центром, липидные, диоксида азота) (Малахов, 2009).
NO увеличивает активность антиоксидантных ферментов и экспрессию кодирующих их генов (Соловьева et al, 2016).