Иммунологические методы исследования

Иммунодиагностика — использование реакций иммунитета для диагностики инфекционных заболеваний.

Реакции иммунитета — реакции между антигеном (Аг) и антителом (Ат). Они описываются простым уравнением Аг + Ат = результат. Основная их характеристика — специфичность. Реакции иммунитета к лаборатории применяют в двух направлениях:

— для серологической диагностики, т.е. для определения в исследуемом материале (чаще сыворотка крови) неизвестных Ат, используя для этого стандартный антигенный препарат-диагностикум, приготов­ленный, как правило, из эталонных штаммов микроорганизмов;

— для иммуноиндикации, т.е. для обнаружения в исследуемом мате­риале микробных Аг, т.е. определения присутствия антигенов возбудителя с помощью известного Ат, содержащегося в иммуно-диагностических сыворотках.

Реакция агглютинации и ее разновидности

Агглютинация — склеивание и осаждение микроорганизмов, эри­троцитов или других клеток при действии на них специфических Ат в присутствии электролита. Выделяют две фазы реакции.

— В первой, специфической фазе происходит взаимодействие Ат с Аг и образование комплекса Аг-Ат.

— Во второй, неспецифической фазе комплекс Аг—Ат выпадает в оса­док. Это происходит только в присутствии электролита.

Реакцию агглютинации по идентификации ставят как в ориенти­ровочном, так и в развернутом вариантах. Ориентировочную реакцию агглютинации ставят на предметном стекле с неразведенными или разведенными 1:10 адсорбированными агглютинирующими сыворот­ками, содержащими Ат одной специфичности. Результаты учитывают невооруженным глазом через 2—5 мин. Реакция считается положи­тельной, если в результате отмечают появление хлопьев, жидкость становится прозрачной. При отрицательном результате жидкость остается мутной, хлопья не образуются.

При постановке реакции агглютинации по идентификации с не- адсорбироваными сыворотками на стекле необходим второй развернутый вариант: иммунную агглютинирующую сыворотку разводят до титра, обя­зательно используя разведение до 1/2 титра. Культуру считают идентичной взятой сыворотке, если она агглютинируется ей в разведении 1/2 титра и выше, так как в этих разведениях содержатся только видовые Ат.

Реакцию агглютинации ставят и с целью определения Ат в сыво­ротке больного, а также их количества. В качестве Аг используют диагностикум. В пробирках готовят ряд двукратных разведений сы­воротки. В каждую пробирку вносят 1—2 капли диагностикума, помещают их на 2 ч в термостат при 37 °С, после чего предварительно учитывают результаты, начиная с контрольных пробирок. Отсутствие агглютинации в контрольных пробирках (помутнение) и появление хлопьев в опыте свидетельствуют о наличии Ат. Диагностически зна­чимым считают нарастание титра Ат в парных сыворотках больного, взятых в разные дни болезни. Подобная динамика свидетельствует об инфекционном происхождении Ат.

 

Существуют разновидности реакции агглютинации — реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция коагглютинации, реак­ция торможения пассивной (непрямой) гемагглютинации (РТПГА).

Реакция пассивной гемагглютинации

Пассивная (непрямая) геммагглютинация — взаимодействие Ат (Аг) с Аг (Ат), предварительно адсорбированными на поверхности эри­троцитов. Если комплекс образовался, то эритроциты склеиваются и выпадают в осадок. Реакцию ставят в лунках полистироловых план­шетов, в которых готовят разведение парных сывороток, в последних лунках 2 контроля: заведомо положительная сыворотка и физиологи­ческий раствор. Затем последовательно во все лунки с разведениями добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум и инкубируют 2 ч. Если произошла гемагглютинации, то эритроциты оседают на дне лунки, заполняя всю лунку (зонтик). Если результат отрицательный, эритроциты оседают в центре (пуговка). Это позволяет установить титр Ат и его нарастание.

При иммуноиндикации реакцию ставят качественно с антительным фитроцитарным диагностикумом и фильтратом исследуемого материала.

Реакция коагглютинации

Реакцию коагглютинации чаще используют в вирусологии, так как она позволяет обнаружить невидимую на глаз вируснейтрализацию. Она основана на том, что Staphylococcus aureus имеет в составе кле­точной стенки белок А, способный связываться с Fc-фрагментом IgG и IgM. Активные центры Ат свободны и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами Аг. При постановке реакции на предметное стекло наносят взвесь стафилококков, сенсибилизиро­ванных соответствующими Ат, к которой добавляют каплю взвеси исследуемых вирусов. Если Аг соответствуют Ат, через 30—40 с про­исходит агглютинация между образовавшимися комплексами Аг—Ат, содержащими белок А.

Реакция торможения пассивной (непрямой) гемагглютинации

РТПГА используют для обнаружения Аг возбудителей в иссле­дуемом материале при добавлении к нему диагностической иммунной сыворотки. При наличии гомологичного Аг происходит связывание Ат, а после добавления сенсибилизированных Аг эритроцитов их агглютинации не происходит. Отсутствие гемагглютинации расценивается как положительный результат реакции. Реакцию РТПГА при­меняют и для обнаружения специфических Ат. Для этого к исследуе­мой сыворотке добавляют Аг. Если в ней содержатся специфические Ат, то они связываются с Аг. При добавлении эритроцитов, сенсиби­лизированных Ат, их склеивания не происходит. Оценку результатов лучше проводить при работе с разведениями парных сывороток.

Реакция преципитации и ее разновидности

Реакция преципитации — осаждение (преципитация) Аг, находяще­гося в дисперсном, коллоидном состоянии под действием специфи­ческих Ат. Существует несколько разновидностей постановки этой реакции.

Кольцепреципитация

Эту реакцию ставят в преципитационных (узких) пробирках с иммунной преципитирующей сывороткой, на которую наслаивают растворимый Аг. При эквивалентном соотношении Аг и Ат на грани­це двух растворов образуется белое кольцо преципитации.

Если в качестве Аг в этой реакции используют прокипяченный и профильтрованный водный экстракт органов и тканей, то реакцию называют термопреципитацией (реакция Асколи для диагностики сибирской язвы).

Иммунодиффузия

Метод основан на взаимодействии гомологичных Ат и Аг в агаровом геле с образованием полос и колец преципитации. Иммунодиффузию используют для определения токсигенности дифтерийных бактерий, концентрации иммуноглобулинов в сыворотке и др.

В последнем случае на стеклянную пластинку строго определенно­го размера (или в чашку Петри) аккуратно заливают расплавленный агар, содержащий в определенной концентрации антисыворотку к тому или иному классу иммуноглобулинов. В центре слоя застывшего агара и по периферии пробойником делают лунки, располагая их на определенном, одинаковом расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят стандартную сыворотку с известной концентрацией иммуноглобулина, например IgG, а в периферические лунки — иссле­дуемые сыворотки. Из стандартных и исследуемых сывороток IgG диффундирует в агар. При образовании комплекса происходит его диффузия в агар, образуются кольца преципитации. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации иммуноглобулина. Величину диаметра соотносят с калибровочной прямой, построенной по стандартным сывороткам, и определяют содержание иммуногло­булина в исследуемых сыворотках.

Иммуноэлектрофорез

Иммуноэлектрофорез основан на электрофоретическом разделе­нии Аг в геле с последующей их преципитацией Ат иммунной сыво­ротки. Иммуноэлектрофорез позволяет провести углубленный анализ и идентификацию отдельных Аг в многокомпонентных системах.

На пластинку из стекла наносят слой агара. Вначале антигены, помещенные в центре такой пластинки, разделяют в электрическом

поле. Затем в канавку агара, вырезанную параллельно линии разделе­ния Аг, добавляют иммунную сыворотку, происходит диффузия ком­понентов реакции навстречу друг другу, и в месте встречи образуются дуги преципитации. С помощью этого метода анализируют состав белков сыворотки крови, спинномозговой жидкости, мочи.

 

 

Иммуноблоттинг

Метод основан на сочетании электрофореза и иммуноферментного анализа (ИФА). В полисахаридном геле с помощью электрофореза выде­ляют Аг, затем проводят блоттинг (наложение), т.е. переносят его из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и продол­жают электрофорез. После чего на пленку наносят сыворотку пациента и инкубируют. Далее отмывают несвязавшиеся Ат и проводят ИФА. Для этого на пленку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и субстрат, который меняет окраску при взаимо­действии с ферментом. Если образуется комплекс Аг—Ат—антисыворотка к иммуноглобулинам, на носителе появляются окрашенные пятна.

Реакция лизиса

Реакция иммунного лизиса. Реакция основана на том, что Ат-лизины способны растворять микроорганизмы только в присутствии комплемента. Для проведе­ния реакции готовят ряд разведений инактивированной нагреванием сыворотки, затем добавляют взвесь микроорганизмов и комплемент. Всё инкубируют. После инкубации в термостате проводят оценку результатов с помощью высевов с количественным учетом. Для кон­троля используют исследуемую культуру микроорганизмов, нормаль­ную сыворотку и комплемент.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) — сложная, многокомпо­нентная реакция, состоящая из двух систем:

• первая система (тест-система): Аг+Ат+комплемент, где Аг или Ат — неизвестный компонент;

• вторая система (индикаторная, или гемолитическая, система): эритроциты барана + гемолитическая сыворотка.

Если на первом этапе реакции произошло специфическое взаимо­действие Аг и Ат, то комплемент адсорбируется на образовавшемся комплексе. Процесс связывания комплемента визуально не прояв­ляется. В связи с этим используют вторую индикаторную систему — гемолитическую, состоящую из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки (гемолитическую сыворотку получают при иммунизации кролика эритроцитами барана). Эта индикаторная система высоко­чувствительна к свободному комплементу. В его присутствии проис­ходит иммунный гемолиз.

В зависимости от присутствия обнаруживаемых Аг или Ат возмож­но два исхода.

• Если на первом этапе образовался комплекс Аг-Ат, то на нем адсорбируется комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит, так как комплемента в свободном состоянии не осталось. (Все компоненты реакции берутся в строго определенных рабочих дозах.)

• Если в исследуемой сыворотке комплекс Аг—Ат не образовался, то комплемент остался в свободном состоянии, и он адсорбируется на комплексе гемолитической системы. Визуально это проявляется в лизисе эритроцитов и образовании «лаковой» крови.

Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в реакции, титруют.

Титр гемолитической сыворотки — ее наибольшее разведение, кото­рое вызывает полный гемолиз эритроцитов в течение 1 ч при 37 °С.

Рабочая доза гемолитической сыворотки равна тройному ее титру.

Титр комплемента — наименьшее его количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов.

Рабочая доза комплемента — в основном опыте РСК (в объеме 0,5 мл) должна быть выше титра на 20—30%.

Тктр антигена — минимальная доза, не вызывающая задержку гемолиза.

Для РСК используют рабочую дозу Аг = 1/2 ее титра.

Реакции иммунитета с использованием метки

Реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) основана на использова­нии флюорохромов, химически связанных с Ат. При этом меченные люминесцентной меткой Ат вступают во взаимодействие с корпускулярным Аг. Образовавшиеся специфические комплексы обнаружива­ют по интенсивному свечению, регистрируемому с помощью люми­несцентного микроскопа. Существуют разновидности этой реакции.

При постановке прямой РИФ используют противомикробные флюо­ресцирующие Ат, т.е. реакция происходит против возбудителя.

Непрямая РИФ (РНИФ) проходит в два этапа. На первом этапе используют обычные антисыворотки к анализируемому возбудителю. Образовавшиеся при этом комплексы Аг-Ат на втором этапе выявля­ют с помощью люминесцентной сыворотки, которая содержит мече­ные Ат против иммуноглобулина того вида животного, сыворотка которого использована на первом этапе реакции.

Иммуноферментный анализ

Метод основан на использовании меченных ферментом сыворо­ток. Индикацию образовавшихся комплексов проводят по химиче­ской реакции между ферментом и субстратом, сопровождающейся изменением цвета. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов Аг и меченных ферментом Ат. В качестве фермента чаще всего бывает пероксидаза или щелоч­ная фосфатаза. Для проведения анализа используют твердофазный носитель с сорбированным Аг или Ат. Реакцию можно ставить для обнаружения как Аг, так и Ат.

Основные этапы реакции по обнаружению Ат:

• Сорбция известного Аг в лунке планшета.

• Внесение исследуемой сыворотки; промывка.

• Внесение меченной ферментом антиглобулиновой сыворотки; промывка.

• Внесение хромогенного субстрата.

• Регистрация реакции.

Основные этапы реакции по обнаружению Аг:

• Сорбция известного Ат в лунке планшета.

• Внесение Аг содержащего материала; промывка.

• Внесение Ат той же специфичности, но другого вида животного.

• Внесение меченной ферментом сыворотки против иммуногло­булинов того вида животного, сыворотка которого была использована последней; промывка.

• Внесение хромогенного субстрата.

• Регистрация реакции.

 

Радиоиммунный метод

В основе радиоиммунного анализа (РИА) лежит использование Ат, меченных радиоактивной меткой. Материал, в котором ищут неиз­вестный Аг, обрабатывают такой сывороткой. Если в исследуемом материале есть соответствующий Аг, образуется комплекс Аг—Ат, обладающий радиоактивностью, которую легко выявить с помощью специального счетчика. Если соответствующих Аг в исследуемом материале нет, то меченные радиоактивной меткой Ат не связываются и легко удаляются на этапе промывания. Как и реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный анализ может быть проведен в прямом и непрямом вариантах для обнаружения Аг

Молекулярно-генетические методы исследования

ДНК-гибридизация

Различают две методики гибридизации:

• гибридизация, проводимая в растворе;

• гибридизация, проводимая на твердой поверхности.

Гибридизация в растворе

При реализации этого метода искомая нуклеиновая кислота и зонд взаимодействуют в водной реакционной смеси, что повышает ско­рость процесса гибридизации.

Метод ДНК-гибридизации основан на способности денатуриро­ванной одноцепочечной ДНК достраивать гомологичную цепь в бес­клеточной системе. В качестве материала для второй цепи используют ДНК-зонды (коммерчески производимые фрагменты молекулы известной ДНК, гомологичные фрагментам искомой ДНК возбудите­ля, меченные радиоактивным изотопом или ферментом).

При наличии в исследуемом материале гомологичных участков ДНК по закону комплементарности ДНК-зонд взаимодействует с ним.

Учет результатов проводят по уровню радиоактивности или при добавлении к пробе субстрата, который соответствует используемому в зонде ферменту. Образование специфического комплекса субстрат-фермент означает, что в исследуемом материале есть ДНК, соответ­ствующая ДНК-зонду.

 

Гибридизация на твердом носителе (блот-гибридизация)

Основана на ДНК-гибридизации зонда на твердой поверхности, в качестве которой используют полимерный мембранный фильтр. Основные этапы исследования:

• исследуемый образец обрабатывают ультразвуком для получения коротких фрагментов находящихся в нем ДНК;

• проводят денатурацию нуклеиновой кислоты;

• денатурированные нуклеиновые кислоты наносят на мембран­ный фильтр и фиксируют;

• проводят предварительную гибридизацию со специальным буфе­ром при 65 °С;

• добавляют гибридизационный буфер, который содержит денату­рированный зонд, и проводят гибридизацию при 65 °С.

«Сэндвич»-гибридизация

Этот метод предполагает использование двух видов ДНК-зондов, которые гомологичны различным участкам искомой нуклеиновой кис­лоты. Чтобы связать искомую нуклеиновую кислоту, присутствующую в исследуемом образце, один зонд фиксируют на мембране. После окон­чания процесса гибридизации мембрану отмывают от исследуемого мате­риала и добавляют раствор, который содержит второй зонд, несущий метку. После этого процесс гибридизации повторяют, при этом мече­ный зонд взаимодействует с искомым участком нуклеиновой кислоты. Окончательная детекция зависит от характера меток, которые могут быть ферментно-гибридизационными, флюоресцентными, хемилюминесцентными и т.д.

Гибридизация in situ

Процесс гибридизации проводят непосредственно на срезе или в мазке с использованием зондов. Основу метода составляет прин­цип твердофазной гибридизации или гибридизации в растворе. Используемый в реакции зонд содержит флюоресцентную метку. После окончания процесса гибридизации связавшиеся молекулы в исследуемом мазке или срезе выявляют под флюоресцентным микроскопом. При данном методе возможен количественный ана­лиз.

 

Полимеразная цепная реакция

Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) основан на естественной репликации ДНК, которая включает денатурацию спирали ДНК, расхождение нитей и комплементарный синтез новых нитей ДНК. ПЦР обеспечивает амплификацию фрагментов генома и быстрое накопление определенной последовательности ДНК. В резуль­тате получают большое количество ДНК, которое достаточно для про­ведения анализа различными методами детекции.

Для реакции используют набор праймеров фрагментов ДНК, которые являются маркерами данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей дена­турированную одноцепочечную ДНК возбудителя, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшиеся двунитевые фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, и так повторяется много раз, поэтому реакция носит цепной характер. За 2-3 ч происходит 30-40 циклов амплификации, что приводит к образованию большого коли­чества соответствующих копий нуклеотидных последовательностей, которое можно зарегистрировать.

Компоненты реакции:

• Праймеры-олигонуклеотиды, состоящие из 15-30 нуклеотидов, комплементарных участкам на идентифицируемой матричной ДНК.

• Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов — строительный материал, используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

• Taq-полимераза, обладающая ДНК-полимеразной активностью.

• Буферный раствор, катализатор фермента Taq-ДНК-полимеразы.

• Исследуемый образец — препарат, который служит мишенью для последующей амплификации.

ДНК-чипы

Технология ДНК-чипов основана на гибридизации нуклеотидной последовательности исследуемого материала с известными ДНК-последовательностями, расположенными в определенном порядке, иммобилизованными на поверхности стекла или кремня. Результат реакции детектируют по флюоресценции зонда, предварительно меченного флюорохромом и гибридизированного с одной из иммобилизированных проб.

Биочип — матрица, состоящая из ячеек. В каждой ячейке закре­плен олигонуклеотид (последовательность из нескольких нуклеино­вых кислот). Каждый нуклеотид имеет одинаковую длину и отлича­ется от другого последовательностью аминокислот.

Исследуемый образец наносят на все ячейки чипа, а затем через некоторое время сливают. Если имеется нуклеотид комплементарный шкрепленному в ячейке, то между ними образуется связь, и после нромывания они не удаляются. Затем образец исследуют под флюо­ресцентным микроскопом, который регистрирует результат образования комплекса по световому сигналу. Светящиеся ячейки кодируют олигонуклеотиды исходной пробы. Таким образом, зная нуклеотиды, которые были изначально помещены в данной ячейке, можно сделать нывод о составе фрагмента исследуемой ДНК.