Суть эксперимента заключается в том, что влияя на определенные механизмы, которые обеспечивают транспортные процессы в мембране (эндоцитоз (процесс интернализации – возвращения рецепторов из мембраны в цитоплазму), экзоцитоз (обратный процесс)), то …?
Здесь транспортные системы – микротрубочки (рельсы разной толщины), они обеспечивают в клетке транспорт и поддержание жесткости мембраны (актиновые нити).
Это напоминание, чтобы не забыли)
Еще одно напоминание)
И еще одно))
Еще одно..
В этом исследовании использовали большое кол-во разных ингибиторов (блокаторов), которые влияют на транспорт постсинаптических рецепторов (эндосом, которые таскают). Это неполный список. Внимательно рассмотрите эту таблицу, он просто читает несколько из таблицы примеров.
Сейчас это все рассмотрим.
Моделью всех этих экспериментов является депрессия. Цель – показать, как влияют эти вещества на депрессию.
Желтые столбики – контроль (без блокаторов), синие – с блокатором. За стандарт была взята первая пробы, и все остальные пробы измерялись относительно уровня первой пробы. Были использованы вещества, которые блокируют эндоцитоз (DIP – dynamyninhibitoryprotein и динасор).
Динамин. Когда клатрин захватывает участок мембраны с рецептором, происходит инвагинация и образуется пузырек (с помощью белка, замыкающего пузырек). Если блокируем динамин – эндоцитоз ослабляется, пузырек не замыкается, рецепторы остаются в мембране, во вполне функциональном состоянии. Депрессия, происходящая за счет эндоцитоза ослабляется, токи не будут значительно уменьшаться. Если интервалы 3х минутные, мы получаем известную нам депрессию. Первые 3 стимула вызывают снижение, затем наступает фаза стабилизации, и затем при увеличении интервала до 5 минут – восстановление тока. Если мы заблокируем динамин, то мы очень долго будем наблюдать ослабленную депрессию.
Динасор оказал более мощный эффект на нашу депрессию. Динасор более эффективно подавляет функции динамина и вызывает меньшую депрессию.
Это просто другая иллюстрация.
Это рецепторы уже захваченные молекулами клатрина (зеленым), розовый – белок адаптор (обеспечивает прикрепление динамина к мембране). Динамин обеспечивает схлопывание везикулы в кружок. Специальные белки освобождают везикулы от клатриновой оболочки. Остается пузырек, образованный мембраной и его тащат внутрь клетки.
Эти пузырьки транспортными системами должны обеспечить перемещение рецепторов в радиальном направлении внутрь цитоплазмы (это наз. радиальная диффузия). В этих процессах участвуют микротрубочки и для них есть специальные блокаторы (колхицин и винбластин). Колхицин – вещество, которое разрушает микротрубочки. МКРТ необходимы для того, чтобы утащить везикулы в сторону. Колхицин действует на МКТР тотальны и все рецепторы блокируются. Все рецепторы остаются в мембране и обеспечивают наши АЦх токи. Эффект на МКРТ очень выражен.
Винбластин обладает меньшим эффектом и действует только на первой аппликации примерно. К 4ой аппликации эффект уже сильно ослаблен.
То же самое.
Эти вещества оказывают точно такие же эффекты на депрессию.
Фаллоидин более эффективен, чем цитохалазин В.
То же самое.
Актиновыемикрофиламенты. Зеленые – актиновые нити (они бывают упорядоченные и еще какие-то, это позже). Здесь показаны МКРТ, по которым шагают цистерны. Актиновые нити нужны, чтобы утащить наши рецепторы. Они растут и их рост отталкивает от поверхности мембраны эндосомы с рецепторами. Гиферин – белок, который обеспечивает жесткость глициновых рецепторов. Полимеризация актина приводит к тому, что он толкает эти молекулы. Об этом в следующей лекции.
Экзоцитоз. Применялся ингибитор экзоцитоза (Exo 1), который устраняет фазу встраивания (на следующем рисунке ниже обведена в красный кружок). Депрессия тоже устраняется, так как не работает механизм экзоцитоза.
ВОТ)
Это просто демонстрация того, что происходит в мембране.
Показано, что за счет удаления структурных белков (скаффолд) кластер рецепторов разрушается на отдельные рецепторы и они растекаются в разные стороны и потом их поглощают эндосомы. Но может быть у них и другая судьба)
У МКРТ есть два конца (+ и -). + эта та сторона, которая растет.
Антероградный транспорт – от тела клетки к периферии;
Ретроградный – наоборот.
Выделены 2 миозина, которые обеспечивают перемещение наших эндосом.
- Миозин 6 (заостренный)
- Миозин 5 (оперенный)
- Миозин 2.
Принцип эксперимента тот же. Использовался блокатор ML-7, который влиял на динамику экспрессии АЦх-тока.
Применялся растворитель DMSO, он нейтральный и не влияет на функции. Сиреневые столбики – хорошая депрессия. ML-7 проникает через мембрану и ингибирует киназу легких цепей миозина. Блокатор достоверно снижает А АЦх-токов и это сопровождается интернализациейАЦх-рецепторов. То есть миозины участвуют в транспорте (док-во).
Второй блокатор MLCKIP18 дает абсолютно точно такой же эффект.
Еще использовались другие блокаторы, которые ингибируют миозин 2. У27632 ингибирует киназу, которая ингибирует миозин 2. Показан стандартный эксперимент.
Доказали, что миозин 2 не мышечный блокатор.
В нормальных условиях, когда экспрессия нормальная и ничто ей не препятствует, токи круто изменяются. А с применением этих двух ингибиторов (ML-7 и MLCK-IP-18) миозина 5 и 6 эффект снижается. Депрессия здесь снижена. Ч/з 15 минут практически все это восстанавливается.
Это модельный эксперимент Пивоварова. В контроле депрессия одна, а с блокаторами другая (см. рисунок выше).
Здесь сравниваются эффекты разных блокаторов. Все они примерно одинаково снижают депрессию. Эти вещества сопряжены.
Актиновые нити и актин-миозиновый комплекс участвует в мобильности постсинаптических рецепторов. Здесь показаны процессы, которые приводят к интернализации рецепторов. Есть адаптерные элементы, к которым приклеивается клатрин, таким образом освобождаясь от актиновых нитей, которые его удерживают и садится в это место. И здесь показан обратный процесс (разборка). Для того, чтобы подошел клатрин, необходимы актиновые нити (жесткость). Клатрин участвует так же в отщеплении молекул динамина. Отделение везикулы от цтпл мембраны, и все идет внутрь.
Честно, не очень поняла, где здесь разборка, ну)