Хранение спермы вне организма, цель которого - увеличить срок выживаемости спермиев и сохранить оплодотворяющую способность спермы при хранении в замороженном или незамороженном состоянии, основано на снижении интенсивности обменных процессов в сперме, иными словами, на создании условий, при которых спермин впадают в анабиоз.
Разработаны различные методы хранения спермы: кратковременное хранение (спермы быков, баранов, хряков и жеребцов) при температурах выше 0°С и длительное хранение в жидком азоте (спермы быков и жеребцов).
Хранение спермы быка и барана при 2…5°С. Свежеполученную сперму быков и баранов после оценки ее качества разбавляют средой, снова проверяют под микроскопом активность спермиев и фасуют.
Слишком быстрое охлаждение спермы приводит к гибели спермиев от температурного шока. Поэтому фасованную сперму охлаждают до температуры 2…50С постепенно - в течение 2…3 ч. Для этой цели разбавленную сперму быка вначале помещают в стеклянный стакан с теплой водой (30°С), а затем переносят на водяную баню (220С) на 20 мин, после чего фасуют при комнатной температуре.
Сперму барана (фасованную) выдерживают при комнатной температуре 10…15 мин. Ампулы, пробирки или флаконы обертывают слоем ваты или упаковывают в поролоновые амортизаторы, помещают в полиэтиленовые или резиновые мешочки, которые герметически закрывают, и постепенно охлаждают до 2…5°С в бытовом электрохолодильнике или в пищевом термосе со льдом. Упаковку со спермой кладут на лед или обкладывают ее льдом со всех сторон.
Разбавленную сперму быка, сохраняемую при 2…50С, используют для искусственного осеменения коров и телок в течение 3 сут при активности спермиев не ниже 7 баллов; сперму барана используют в течение 1 сут, иногда 36 ч при активности спермиев не ниже 8 баллов.
Хранение спермы быка при температуре 2…200С. Были предложены синтетические среды, благодаря которым можно сохранять сперму при сравнительно высоких температурах, например разбавитель ТВТ-12 (температура хранения от 15 до 180С), а также сульфатная среда НСС (температура хранения от 2 до 20°С).
Хранение спермы жеребца при 2…50С. Разбавленную сперму жеребца после повторной проверки на активность спермиев фасуют в стерильные стеклянные баночки объемом 50…100 мл и закрывают притертыми пробками, которые закрепляют резиновым кольцом. Баночку со спермой помещают в трехслойный марлевый или полиэтиленовый мешочек и переносят в термос со льдом. Для хранения и перевозки спермы используют термос конструкции Всесоюзного научно-исследовательского института коневодства. Сперму жеребца, сохраненную при температуре 2…5°С, можно использовать для осеменения кобыл в течение 48 ч.
Хранение спермы хряка при 16…200С. Полученную сперму разбавляют средами ГХЦС или ГХЦ, оценивают активность спермиев. Сперму разливают в стеклянные колбы или полиэтиленовые флаконы, которые негерметично прикрывают целлофаном или пергаментной бумагой и хранят в темном месте при температуре 16…20°С. При более низкой температуре (но не ниже 6°С) сперму разбавляют ГХЦСЖ или ГХЦЖ. Сперму, сохраняемую при плюсовых температурах, используют для осеменения свиноматок в течение 3 сут при активности спермиев не ниже 6 баллов.
Хранение спермы быка, барана, хряка, жеребца в жидком азоте. Благодаря замораживанию можно хранить сперму несколько лет и даже десятилетий, перевозить на любые расстояния и всегда иметь на станциях сперму лучших производителей.
При температурах выше 0°С обменные процессы в сперме хотя и замедляются, но не прекращаются. Продолжается накопление вредных продуктов распада и начинается процесс разрушения передней части головки спермия - акросомы, которая выполняет важную функцию при оплодотворении яйцеклеток.
Удлинить сроки хранения спермы можно путем еще большего замедления обменных процессов, для чего необходимо охладить ее до отрицательных температур. Но уже при -0,6°С сперма начинает замерзать, а спермии погибают. Основная причина гибели - кристаллическое замерзание воды. Теоретической основой метода быстрого замораживания спермы послужила гипотеза о возможности стеклообразного некристаллического замерзания (витрификация) биологических объектов (в том числе и спермы).
Если сперму охлаждать медленно, то вся вода, содержащаяся в ней, успеет превратиться в ледяные кристаллы и спермии погибнут. При очень быстром охлаждении удается «проскочить» опасную температурную зону кристаллизации и достичь зоны витрификации, где протоплазма спермиев затвердевает как единое целое, без вымерзания воды и образования кристаллов льда; при этом сохраняется тонкая структура протоплазмы и ядра. Глубокое охлаждение спермы до температуры жидкого азота достигается в течение нескольких минут.
Замораживание спермы быка. Для замораживания в жидком азоте пригодна сперма с концентрацией спермиев не менее 0,8 млрд/мл и активностью не ниже 8 баллов. На фторопластовых пластинах в форме гранул сперму замораживают так. После получения и оценки сперму разбавляют лактозо-желточной средой с глицерином. Среду подогревают до 30…350С. Сперму разбавляют в 2… 10 раз и более в зависимости от объема гранул. Если объем гранул 0,1…0,2 мл, то необходимы меньшие степени разбавления, и тогда на пункте искусственного осеменения сперму перед использованием надо разбавить: для этого гранулы размораживают во флаконе с 1 мл 2,9%-го раствора цитрата натрия, подогретого до 38…400С. Сперму, предназначенную для размораживания в гранулах объемом 0,5 мл, разбавляют в 10 раз и более и перед осеменением больше не разбавляют. Для осеменения коров две гранулы помещают в стерильный флакон и погружают его в теплую воду (38…40°С).
Разбавленную сперму охлаждают до 2…5°С в течение 3…4 ч, а затем разливают градуированными пипетками, полиэтиленовым шприцем или разливочной машиной в лунки охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластины. Пластину выдерживают над поверхностью жидкого азота на расстоянии 5…10 см в течение 1,5…2 мин, а затем погружают ее в жидкий азот на 1…2 мин. После замораживания спермы пластину вынимают из жидкого азота, гранулы собирают в сачок или контейнер и пересыпают в охлажденный контейнер, который помешают в сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения. Уровень азота в сосудах должен быть значительно выше чашек с замороженной спермой. Перед осеменением из чашек пинцетом достают охлажденные до -1960С гранулы, размораживают их, оценивают активность спермиев и используют для осеменения коров при активности спермиев не ниже 4 баллов.
В облицованных гранулах (но Остатка) (рис. 5) замораживают свежеполученную сперму, разбавленную средами №1 и 2. Приготовленные среды наливают в стерильные полиэтиленовые флаконы по 200…400 мл, которые подсоединяют к специальному устройству для разбавления. Сперму сначала разбавляют средой №1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре 5…10 мин, затем средой №2 до требуемой концентрации (15 млн в дозе).
Сперму разбавляют с помощью специального устройства, благодаря которому можно дозировано вводить среды в отдаленную часть одноразового полиэтиленового спермоприемника со спермой.
Рис. 5 Схема замораживания спермы в облицированных гранулах (по Ф.И. Осташко):
- спермоприемник; 2 - дозирующее устройство; 3 - перефасовка спермы в тонкостенную трубку; 4 - дозирующий аппарат для герметизации спермы; 5 - замораживание спермы; 6 - инструмент для осеменения коров
Спермоприемник соединяют с тонкостенной полимерной трубкой диаметром 3,8…4 мм и толщиной стенки 120 мкм, выдавливают в нее разбавленную сперму. Заполненную спермой трубку разделяют с помощью автомата ПРЖ на дозы 0,25…0,33 мл и герметизируют путем термической сварки. Облицованные (герметизированные) гранулы помещают в алюминиевые тубы, которые закрывают поролоновыми пробками и закрепляют в обоймах специального устройства для эквилибрации и замораживания спермы. Устройство помещают в холодильник и выдерживают при 2…5°С 4…6 ч, затем обойму аппарата с тубами погружают в жидкий азот на 8… 10 мин, после чего переносят на длительное хранение в сосуд Дьюара.
Активность спермиев после замораживания спермы проверяют через 24 ч. Из каждой тубы берут по одной грануле и помешают в воду температурой 400С. Упаковку гранулы вытирают марлевой салфеткой, вскрывают ножницами и определяют активность спермиев. Для дальнейшего хранения в жидком азоте допускают сперму с активностью спермиев не ниже 4 баллов. При хорошем качестве спермы тубы закрывают поролоновыми пробками, отсоединяют от обоймы и помещают в сосуды Дьюара с жидким азотом.
В полипропиленовых трубочках, или соломинках (пайеттах), замораживают сперму, предварительно разбавленную средой ЛФРМГЖ с таким расчетом, чтобы после оттаивания в соломинке содержалось не менее 15 млн подвижных спермиев. Каждую соломинку маркируют: указывают наименование предприятия, кличку и номер быка, дату получения спермы. Разбавленную сперму расфасовывают по 0,25 мл с помощью машины, которая автоматически наполняет спермой соломинки и закупоривает их с обоих концов стерильными шариками. Один шарик служит пробкой-поршнем, а другой герметизирует соломинку.
Можно использовать вакуумный способ. Соломинки с одного конца закупоривают пробкой-поршнем, связывают в пачку и подвешивают к штативу специальной вакуумной камеры. На поддон камеры ставят стакан со спермой и откачивают насосом воздух до давления 0,92 атм, затем насос выключают, при помощи ручки поднимают поддон со спермой так, чтобы открытые концы соломинок погрузились в сперму на 4…5 мм, и в камеру медленно впускают воздух, который нагнетает сперму в соломинки. Затем соломинки раскладывают на штативе с 125 пазами. Счетную рейку заполнят соломинками легким движением ладони руки. Штативы с соломинками кладут в пластмассовые коробки, которые переносят в холодильник, и выдерживают при 40С в течение 3…4 ч. После охлаждения оценивают подвижность спермиев и к замораживанию допускают сперму с активностью не ниже 8 баллов. Сперму замораживают в газообразном азоте на медном сите в стационарном хранилище КВ-6202 при температуре - 120-130°С в течение 5 мин. В пластмассовые стаканы помещают по 500 соломинок и хранят в стационарном хранилище в жидком азоте при температуре -196 0С. Для транспортирования спермы на пункты искусственного осеменения используют другие пластмассовые стаканы на 150 доз спермы, которые хранят в сосудах Дьюара в жидком азоте. Для осеменения берут сперму не раньше 14…20 дней после замораживания.
Замораживание спермы жеребца. Перед замораживанием сперму жеребца разбавляют в 4 раза лактозо-хелато-цитратно-желточной (ЛХЦЖ) или лактозо-желточно-сульфатной (ЛЖС) средой. Разбавленную сперму разливают по 25 мл в охлажденные алюминиевые пакеты, плотно закрывают и замораживают в парах над жидким азотом на пенопластовом поплавке на расстоянии 1…2 см от поверхности в течение 5…7 мин, а затем пакеты переносят в жидкий азот. При замораживании спермы в виде гранул ее наносят по 0,2 мл в лунки плашки, помещенной на сухой лед. Через 5 мин замороженные гранулы собирают, упаковывают в алюминиевые тубы или пластмассовые стаканы и помещают на хранение в сосуд с жидким азотом.
Для перевозки спермы используют различной конструкции сосуды Дьюара и термосы. Для перевозки в жидком азоте применяют специальные стальные двустенные сосуды на 4…50 л с вакуумно-порошковой либо вакуумной многослойной изоляцией: АТ-4, АТ-6, СДС-20 м, СДС-50, «Харьков-34А» и др. Суточный расход жидкого азота в них колеблется от 5 до 10%, в зависимости от размеров сосуда. Правила обращения с ними такие же, как и с жидкоазотными хранилищами большого объема. При транспортировании замороженной спермы самое главное - постоянно поддерживать низкую температуру.
В хозяйстве при получении сосуда с замороженной спермой прежде всего выясняют, достаточно ли в сосуде хладагента, то есть покрыты ли ампулы им сверху. Хранить сперму без хладагента нельзя; размороженную сперму можно использовать только в ближайшие часы.
Если в хозяйстве на пункте искусственного осеменения есть сосуд с жидким азотом, где хранится замороженная сперма, то кассеты или канистры с гранулами, пакеты со спермой в капиллярах-соломинках быстро переносят из одного сосуда в другой, соблюдая технику безопасности.
Обычно со станции искусственного осеменения сперму производителей доставляют на пункты автотранспортом, нередко используют авиа- и железнодорожный транспорт. Основные правила при перевозках спермы: предохранить термосы и сосуды от тряски, не допустить их повреждения и нарушения температурного режима. Сперму важно доставить в возможно короткие сроки. Вместе со спермой в хозяйство направляют в двух экземплярах ордер (один возвращают на станцию), в котором указывают качество спермы. При перевозках по железной дороге или самолетом термосы, упаковки со спермой пломбируют и снабжают этикетками с указанием места назначения и адреса отправителя.
Для перевозки спермы производителей в хозяйства и хранения ее на пунктах при 0…4 и 5…20°С используют термосы разной конструкции (термосы-ящики, бытовые сумки-холодильники), чаще пищевые термосы - двустенные стеклянные колбы с безвоздушным пространством между стенками, помещенные в пластмассовый или жестяной футляр. Колбу закрывают корковой пробкой и крышкой. Пищевые термосы хорошо сохраняют температуру, но они очень хрупки.
Сперму быков и баранов при температуре хранения 0…5 0С перевозят в широкогорлых пищевых или пластмассовых термосах.
Полиэтиленовый термос (конструкции ВИЖ и др.) представляет собой двустенный сосуд на 3,7 л из полиэтилена с порошково-вакуумной термоизоляцией. Температура 2…4°С поддерживается в нем в течение 2 ч. Пробирки, ампулы, флаконы со спермой укладывают в вату или специальные поролоновые амортизаторы. Последние вместе с ордером помещают в прозрачные полиэтиленовые мешочки, которые запаивают, укладывают на лед термоса и сверху кладут небольшое количество льда или снега температурой 0 0С. При более низких температурах спермии погибают.
При транспортировке спермы зимой следует учитывать, что при температуре воздуха ниже -5 0С необходимо утеплить термос.
Для перевозки разбавленной спермы быков и баранов и хранения ее при 10…18 0С используют те же термосы, но заполненные прохладной водой; для поддержания указанной температуры добавляют кусочки льда.
Разбавленную сперму хряков транспортируют в термосах различных конструкций («Харьков ТС-3», поролоновый термос, термос-ящик «Полтавский» или бытовые сумки-холодильники и др.). Сперму, предназначенную для хранения при 10…20 0С перевозят так: колбы (бутылочки, флаконы) со спермой плотно закрывают пергаментной бумагой или целлофаном, закрепляют на горлышке резиновым кольцом и помещают в термос. После доставки спермы на место с колбы снимают резиновое кольцо и хранят сперму негерметически закрытой.
Сперму жеребцов после разбавления транспортируют при температуре 0…5 0С в баночках (50…100 мл) или флаконах из-под антибиотиков с притертыми пробками (последние фиксируют резиновым кольцом), погруженных в термос со льдом (конструкции ВНИИК и др.). Чтобы сперма охлаждалась постепенно, сосуды предварительно помещают в полиэтиленовые или марлевые мешочки, обернув тонким слоем ваты. Сверху кладут лед тонким слоем и закрывают термос крышкой.
Правила техники безопасности при работе с жидкимазотом. Работать нужно в защитных очках, кожаных рукавицах или перчатках. Попадание жидкого азота на незащищенные участки кожи вызывает ожог (обморожение). Попавший на открытый участок тела жидкий азот надо немедленно смыть водой. Заливая азот в неохлажденный сосуд, нельзя заглядывать в горловину последнего, так как есть риск того, что может произойти выброс жидкости азота вследствие образования большого количества газа. Повышенная концентрация азота в воздухе вызывает головную боль, головокружение и даже потерю сознания, поэтому помещения, где хранят жидкий азот, оборудуют приточно-вытяжной или принудительной вентиляцией. Если пострадавший в обморочном состоянии, его немедленно выносят на свежий воздух.
Во время эксплуатации сосуда Дьюара нельзя плотно закрывать его горловину, так как при испарении жидкого азота и прекращении выхода газа в атмосферу будет создаваться повышенное давление внутри сосуда и он может взорваться. Сосуды Дьюара с жидким азотом при транспортировании необходимо хорошо закреплять, чтобы избежать их падения и возможного взрыва. Сосуды, предназначенные для перевозки авиатранспортом, заливают жидким азотом на половину гидравлической емкости. Чтобы предотвратить накопление взрывоопасной смеси в сосуде от обогащения жидкого азота кислородом, содержание последнего контролируют с помощью переносного газоанализатора ГХП-3. Анализ необходим в хранилище 1 раз в год, а в сосудах на пунктах 1 раз в 6 мес. Если содержание кислорода достигло 15%, сосуд опорожняют в месте, очищенном от предметов органического происхождения: дерева, бумаги, тряпок, навоза и пр.
Санитарно-гигиенические требования к перевозке спермы. Цель их - профилактика заразных болезней. Инструменты, термосы и посуду после обеззараживания возвращают на станцию, где их вновь стерилизуют. Особенно за этим надо следить при обслуживании неблагополучного по инфекционным болезням хозяйства (кампилобактериоз, трихомоноз и др.); в данном случае их обеззараживают в обособленном помещении; мягкий упаковочный материал (бумагу, стружку и пр.) немедленно сжигают. Выполнение работ контролирует ветеринарный персонал.
На пунктах искусственного осеменения оценивают только активность движения спермиев. Для проверки качества спермы, сохраняемой при температуре 2-5°С, открывают термос, берут из флакона каплю спермы, кладут на предметное стекло и исследуют под микроскопом подвижность спермиев. Пробу надо брать быстро, чтобы не допускать нагревания спермы.
Исследуют сперму при температуре 40-41 0С, для этого используют обогревательные столики различных конструкций (В.А. Морозова и др.) или термостаты. Нельзя подогревать предметное стекло на пламени спиртовки или другими методами без контроля температуры. При активности спермиев быка ниже 7 баллов, барана - 8. жеребца - 5 и хряка - 6 баллов сперму не используют для осеменения.
Порядок оттаивания замороженной спермы приведен в таблице 2. Оттаянную сперму в любой расфасовке вынимают из водяной бани и оставляют при температуре 18-20 0С до использования, но не более 10-15 мин. Вновь замораживать оттаянную сперму нельзя. Подвижность спермиев в оттаянных необлицованных гранулах определяют так же, как в сперме, сохраненной при температуре 2-5°С. Оболочку упаковки доз спермы в облицованных гранулах 2 после оттаивания гранул насухо вытирают марлевой салфеткой, край упаковки зажимают между двумя предметными стеклами с помощью специальных кается использование оттаянной специальных пружинных зажимов пли бельевых прищепок. Ставят на обогревательный столик микроскопа под малое увеличение и просматривают спермии через пленочную упаковку. Допускается использование оттаянной спермы с подвижностью спермиев не ниже 3 - 4 баллов для коров и телок, 4 баллов для овец и 2 баллов для кобыл.
Таблица 2. Оттаивание замороженной спермы
| Вид животно-го | Фасовка спермы и доза | Температура оттаивания, 0С | Порядок оттаивания | Продолжительность оттаивания |
| Бык Баран Жеребец | Необлицованные мелкие гранулы по 0,1-0,2 мл Необлицованные крупные гранулы по 0,5 мл Облицованные гранулы по 0,25 мл Соломинки по 0,25 мл Гранулы по 0,2 мл Алюминиевые пакеты по 25 мл Гранулы по 0,5 мл | 40 - 42 40 - 45 40 38 70 - 80 40 40 | Ампулу или флакон с 0,8-1 мл 2,9%-ного стерильного раствора цитрата натрия помещают в водяную баню на 2 -3 мин, затем в теплый раствор опускают одну гранулу Выдержав в водяной бане 2 - 3 мин стерильный флакон, в него опускают две гранулы Дозу спермы пинцетом с широкими браншами опускают в водяную баню Соломинки погружают в водяную баню заводской пробкой вниз, оставляя верхний конец ее на 0,5-1 см выше поверхности воды В разогретый водяной или электрический оттаиватель засыпают одновременно до 20 гранул; оттаявшая сперма стекает в стерильный флакон Удерживают пакет пинцетом, его погружают в водяную баню и слегка покачивают В стерильную коническую колбу быстро насыпают гранулы в один слой и погружают в колбу в водяную баню | 5-8 90 - 120 8 - 10 10-11 До полного оттаивания 45 - 50 До полного оттаивания |