Иммунологические исследования основаны на анализе результатов реакции «антиген - антитело»
В ходе взаимодействия образуются так называемые иммунные комплексы (ИмК)
В иммунологии под антителами (Ат) понимают вырабатываемые организмом человека клетки для защиты от чужеродных организму объектов и веществ-антигенов (Aг).
Реакцию типа «антиген - антитело» проводят одним из двух способов:
1) в пробу, предположительно 00держащую Ат, вводят искусственно полученные, специфичные им антигены и затем определяют наличие ИмК;
2) в пробу предположительно содержащую Aг, вводят искусственно полученные антитела и определяют наличие ИмК.
В обоих подходах зная один из компонентов определяют другой.
Изменения могут проявляться в виде двух основных эффектов, так называемых «феноменов»:
а) агглютинации (корпускулярные частицы Aг во взвеси после реакции c Ат склеиваются и оседают в виде хлопьев);
б) преципитации (происходит укрупнение растворимых антигенных субстанций с возникновением помутнения прозрачных растворов).
Метод иммунодиффузии (ИмД) основан на том, что реакция Аг-Ат происходит внутри тонкого слоя геля, прошив предварительно нанесённого на предметное стекло. Гель позволяет локализовать на стекле образующийся своеобразный «рисунок» - преципитат Растворённые антигены и антитела легко диффундируют в геле и вступают в реакцию друг c другом, при этом иммунные комплексы образуют видимые линии и зоны преципитации.Линии и зоны преципитации могут быть оценены как визуально, так и c помощью денситометров, аналогично тому, как это делается при проведении электрофореза.
Порядок проведения иммуноэлектрофоретического анализа следующий:
1) устанавливают камеру строго в горизонтальном положении;
2) проводят ЭФ-разделение белков (антигенов) в геле;
3) B специальную канавку (Кн), располагающуюся параллельно движению белков (Ar), вносят преципитирующую иммунную сыворотку (антитела);
4) антигены и антитела диффундируют в геле навстречу туг другу и в месте их взаимодействия возникают дугообразные зоны преципитации (Пц). Процесс иммунодиффузии продолжается не менее 24 часов во влажной камере;
5) пластины геля промывают для удаления белков, не участвовавших в преципитации, высушивают и окрашивают тратты специальными красителями. Положение и форма зон преципитации дают представление о составе смеси Aг.
Схема проведения ИЭФА: Аг-антигены; Ат- анитела; Пц-преципитация; Кн-канавка
Следует иметь в виду; что методы ИмЭФА достаточно трудоемки для выполнения и требуют большого количества дополнительного оборудования. Кроме камеры с источником тока, в которой надо поддерживать постоянную температур); для проведения исследований также необходимы: камеры для окрашивания и сушки образцов; пробойники и шаблоны из оргстекла для вырезания лунок в слое геля; вакуум-насос для извлечения гелиевых пробок, подсоединяемый к пробойникам; электропроводящие «мостики», обеспечивающие связь между электродами и гелиевой средой, нанесенной на твердую основу (в качестве них обычно используются пористые материалы - фильтровальная бумага или ткань); штативы для стеклянных пластин; сосуды для промывки образцов и другое оборудование.
Кроме этого, предъявляется ряд особых требований к камере. Материалом для нее должен быть диэлектрик с хорошей теплопроводностью и химической инертностью по отношению к рабочим растворам. Электроды должны быть выполнены из платины, а электродные отсеки отделены от зоны деления специальным лабиринтом для исключения попадания в них продуктов электролиза. Камера должна иметь защитную блокировкy, исключающую поражение оператора электрическим током.
Если в ходе проведения иммунологических исследований при формировании ИМК образуются взвеси, то степень мутности реакционной среды может быть измерена методами игфелометрии (в отраженном потоке) или турбидиметрии (в проходящем потоке).
Порядок проведениянефелометрического анализа следующий:
1) смесь реагентов выдерживают около 30...60 минут при постоянной температуре (инкубация);
2) проводят определение соответствующих характеристик светового потока;
3) оценку результата осуществляют путем определения при помощи калибровочной кривой концентрации ИмК в растворе, затем сравнивают ее со стандартной, которая представляет собой зависимость степени рассеяния или поглощения света от заведомо известного количества ИмК.
Дальнейшее усовершенствование метода лазерной нефелометрии заключается B применении в качестве пассивного носителя частиц латекса с сорбированными на них антигена ми или антителами. В случае взаимодействия частиц Аг и Ат происходит агглютинация, при этом соответствующим образом меняется величина рассеяния света. Метод позволяет определять концентрации частиц до 1 нг/мл.
Использование меченых соединений позволяет при таких концентрациях (до 1 нг/мл) получать не только качественные, по и количественные результаты.
В лабораторной практике применяют несколько основных типов меток: флюоресцентные, радиоактивные и ферментные. Все индикаторные методы делятся на две группы - гетерогенные (с использованием твердой фазы) и гомогенные (без нее).