В геноме Arabidopsis thaliana (двудольное) есть по крайней мере 61 ген кодирующий кинезин и 17 генов миозина. 61 ген кинезина Arabidopsis thaliana кодирует полипептиды с каталитической субъединицей, типичной для кинезинов. У риса (однодольное) выявлено 52 гена кинезина. Классифицировать кинезины можно по-разному: по гомологии, по расположению моторного домена, по направлению движения, по роли в тех или иных процессах, по локализации (связанные с ППК, с веретеном, с фрагмопластом, с аппаратом Гольджи и так далее). Отличительной особенностью моторов растений является широко представленная группа минус конец ориентированных кинезинов. Следует отметить, что в настоящее время считается, что у растений нет динеина и белков, которые регулируют его активность.
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СИСТЕМЫМИКРОТРУБОЧЕК У РАСТЕНИЙ
В клетках растений на стадии интерфазы МТ могут существовать в виде радиальной системы (МТ радиально отходят от ядра), или пучков располагающихся в кортикальной цитоплазме.
РАДИАЛЬНАЯ СИСТЕМА МТ может присутствовать в клетках постоянно или временно:
Постоянно присутствует (СЛАЙД) -
-в эндосперме на синцитиальной и клеточной стадиях развития,
-в микроспороцитах I и II порядка (например, у орхидных).
Временно присутствует (СЛАЙД)
-в сильно вакуолизированных клетках перед митозом (в G2-фазе), когда ядро мигрирует в центр клетки. Эти МТ назвали эндоплазматическими, потому что они располагаются в тяжах, соединяющих узкий ободок околоядерной цитоплазмы с периферической цитоплазмой клетки (весь остальной объем клетки занят вакуолями). Слева показаны эндоплазматические МТ в клетках культуры табака BY-2 (микротрубочки выявляются с помощью GFP-MAP4 и вакуолярная система – c помощью FM4-64);
- также радиальные МТ разной степени выраженности могут присутствовать в соматических клетках в ранней G1 фазе и поздней G2 фазе (это будет видно на других слайдах).
Есть мнение, что радиальную систему МТ следует выделять в отдельную пятую систему. Как осуществляется ассоциация МТ с ядерной поверхностью? Возможно, что на наружной поверхности ядерной оболочки находятся или туда рекрутируются белки-нуклеаторы МТ.
КОРТИКАЛЬНАЯ СЕТЬ МИКРОТРУБОЧЕК присутствует практически во всех клетках, окруженных целлюлозной клеточной стенкой (пример – на СЛАЙДЕ МИКРОТРУБОЧКИ НА СТАДИИ ИНТЕРФАЗЫ). Есть клетки, у которых нет кортикальных МТ, но чаще всего кортикальные МТ присутствуют вместе с радиальными.
СТРУКТУРА КОРТИКАЛЬНОЙ СЕТИ. Кортикальные пучки МТ располагаются под плазмалеммой, и представляют собой перекрывающиеся МТ разной длины. Ориентация и расположение пучков зависит от стадии роста и дифференцировки клеток.
1) Так, в активно делящихся клетках, МТ не имеют упорядоченной ориентации. Хаотическая ориентация кортикальных МТ рассматривается как первичная организация, из которой затем формируются последующие более упорядоченные системы.
2) По мере роста, удлинения и дифференцировки клеток, ориентация МТ упорядочивается и пучки ориентируются перпендикулярно длинной оси клетки (но не всегда – это зависит от направления деления и характера роста). СЛАЙД – (а) В быстро удлиняющихся клетках кортикальные МТ ориентированы перпендикулярно оси роста клеток. Полярность МТ в пучках неоднородна – МТ могут быть ориентированы одно направленно или разно направленно по отношении друг к другу.
3) Однако при замедлении роста (тот же СЛАЙД) (b) пучки меняют ориентацию относительно длинной оси клетки, и часто укладываются параллельно длинной оси клетки.
В клетках из разных органов растений кортикальные МТ будут иметь разное расположение и ориентацию относительно направления роста клеток (СЛАЙД из Fishel and Dixit, 2013).
Были проделаны исследования, которые показали, что новые МТ могут отрастать от поверхности уже существующих МТ. Кроме этого, динамика этих МТ имеет ряд особенностей. Исследование динамики полимеризации МТ в кортексе показало, что МТ находятся в состоянии гибридного тредмиллинга (плюс конец показывает динамическую нестабильность, и минус конец – паузы или деполимеризацию) - СЛАЙД.
(A) Две новые МТ (стрелки) полимеризуются от сайта в кортексе (стрелка) и расходятся от этой точки в разные стороны. (B) Новые МТ (сплошные стрелки) отсоединяются от кортикальных сайтов нуклеации. После отсоединения вторая МТ (стрелка) инициируется в том же месте. (C) Движущаяся МТ (стрелка) пересекает одну МТ перед тем как столкнется со второй МТ и образуется пучок (стрелки). В ходе такого гибридного тредмиллинга, МТ мигрируют в кортексе без участия моторных белков.
ПРОИСХОЖДЕНИЕ КОРТИКАЛЬНЫХ МТ. Перед митозом кортикальные МТ разбираются (так же, как и интерфазные МТ в клетках животных), и появляются снова уже в G1 фазе. Поэтому закономерно встал вопрос о том, как они появляются. Существует несколько вариантов развития событий:
- МТ инициируется в кортикальной цитоплазме;
- Ядерная поверхность инициирует рост МТ, которые отделяются от нее и перемещаются в кортикальную цитоплазму. Там они реорганизуются и формируют кортикальную сеть.
Как известно, маркером нуклеации МТ является γ-тубулин. В клетках растений γ-тубулин присутствует в цитозоле, в связи с поверхностью МТ, также есть ядерная фракция g-тубулина (выявляется в ядре и в области кинетохоров). Какова роль g-тубулина в нуклеации МТ у высших растений?
СЛАЙД из работы Murata et al., 2005. Было показано, что кортикальные МТ нуклеируются при участии γ-тубулина рекрутированного из цитозоля на поверхность уже существующих МТ. Предполагают, что γ-тубулин мигрирует между цитозолем и МТ, и активен только в связи с МТ. Он освобождается в цитозоль после деполимеризации МТ. В геноме Arabidopsis найдены все белки, которые формируют γ-TuSC и γ-TuRC. Сайты нуклеации МТ были обнаружены как в связи с уже существующими в кортексе МТ, так и в зонах, где до этого МТ не было.
Нуклеация в кортексе происходит при участии свободных γ-TuRC, но большая их часть связана со стенками уже существующих МТ. Данные Murata et al указывают на то, что для нуклеации МТ, свободные γ-TuRC рекрутируются на поверхность уже существующих МТ. Новая МТ отрастает от старой под углом в 40о, что выглядит как формирование ветвящихся пучков. Цитоплазматические γ-TuRC перемещаются между цитоплазмой и поверхностью кортикальных МТ, и нуклеирующая активность проявляется только тогда, когда они ассоциированы со стенкой МТ.
СЛАЙД – МОДЕЛЬ НУКЛЕАЦИИ МТ В КОРТЕКСЕ. Интерфазные МТ нуклеируются и заякориваются в клеточном кортексе. (а) Небольшое количество затравок МТ появляются в кортексе в ранней интерфазе. Новые кортикальные МТ формируются из существующих МТ в виде ответвлений, отходящих под определенным углом. Новые МТ открепляются от сайтов нуклеации и мигрируют в кортекс. Нуклеирующий комплекс (NC) остается в том же месте в кортексе после деполимеризации старой МТ, и в течение определенного времени остается функциональным. Стрелки указывают на направление плюс концов МТ. (b) После того как минус конец МТ отсоединяется от сайта нуклеации, МТ ассоциирует с внутренней поверхностью плазматической мембраны (РМ), возможно, всей поверхностью или только у плюс конца МТ, при участии определенных плюс конец кэппирующих белков. Случайная утрата контакта с кортексом, возможно у плюс конца, может вызвать как быструю разборку плюс конца так и его ре-ассоциацию с кортексом.
Участвует ли в этих процессах ЯДРО? Во время митоза в клеточном кортексе практически нет МТ. Поэтому МТ затравки там должны появится de novo. Отходящие от ядра радиальные МТ на стадии ранней интерфазы могут распределять такие затравки от ядра в кортекс. Возможно, что после завершения митоза МТ временно нуклеируются на поверхности ядра и растут в клеточный кортекс. В это же время γ -тубулин сначала аккумулируется у поверхности ядра, а затем перераспределяется в кортекс, что указывает на то, что радиальные МТ могут участвовать в распределении комплексов γ-TuRC от ядра к периферии цитоплазмы. Однако последние исследования показали, что практически на протяжении всей интерфазы большинство новых МТ инициированы de novo у клеточного кортекса и они не являются производными от радиальных МТ.
Варианты нуклеации МТ в клетках растений показаны на СЛАЙДЕ из обзора Hashimoto (2013). (а) МТ нуклеируются от ЯО; (b) в веретене и фрагмопласте аугмин рекрутирует на поверхность МТ γ-TuRC и генерирует нуклеацию новых МТ под острым углом; (с) и (d) в кортексе МТ могут нуклеироваться параллельно материнским МТ (с) или в виде ветвящихся структур под углом около 40 градусов. Параллельные или ветвящиеся модели нуклеации обеспечиваются определенными факторами прикрепления (пока не идентифицированы) и ПТМ, такими как фосфорилирование (показано как Р). Предполагается, что γ-TuRC прикрепляются к МТ в разной геометрической ориентации, в результате чего нуклеируются ветвящиеся или параллельные МТ. По-видимому, геометрия прикрепления зависит от природы рекрутирующих факторов, ПТМ у γ-TuRC. Так, например, у одних типов клеток преобладает ветвящийся вариант нуклеации, а у других – параллельный. Среди регуляторов и адаптерных белков для γ-TuRC у растений известны – агумин (для МТ веретена и фрагмопласта), NEDD1, GIP1 (растительный ортолог белка MOZART1 у млекопитающих).
СЛАЙД – МОДЕЛЬ АКТИВАЦИИ НУКЛЕИРУЮЩИХ КОМПЛЕКСОВ. Не активированные γ-TuRC присутствуют в цитоплазме. Когда они рекрутируются на уже существующие кортикальные МТ, происходит активация нуклеирующей способности. Активированные γ-TuRC связываются с аугмином (голубые квадраты) и возможно, другими регуляторными факторами. Дочерняя МТ отрастает от материнской под углом примерно 40о или параллельно (сейчас рассматривается еще одна модель – МТ могут нуклеироваться не только под углом в 40 градусов, но и параллельно материнской МТ; такой способ нуклеации ведет к мгновенному формированию пучков МТ). Если катанин отрезает минус конец дочерней МТ (фиолетовая стрелка) или динамичный плюс конец дочерней МТ полностью деполимеризауется, нуклеирующий комплекс дестабилизируется и отделяется от материнской МТ. Освобожденный γ-TuRC может затем вступить в новый цикл активации.
ОРГАНИЗАЦИЯ КОРТИКАЛЬНЫХ ПУЧКОВ. Исходя из механизмов нуклеации, МТ полимеризуются в кортексе не в виде упорядоченно ориентированных пучков, а достаточно хаотически. После нуклеации МТ, они обычно отсоединяются от сайтов нуклеации, но остаются заякоренными в кортексе. ЭМ исследования показали, что между МТ и плазмалеммой есть тесная связь. Одно время, основным кандидатом на роль линкера между МТ и плазмалеммой является ассоциированная с плазмалеммой фосфолипаза Д (phospholipase D). Однако, есть и другие «кандидаты» на линкерную функцию между МТ и плазмалеммой: 1) белок CLASP, 2) связанный с мембраной формин (который также обеспечивает связь с мембраной актиновых филаментов), 3) МТ связывающие белки, которые ассоциированы с целлюлоза-синтазными комплексами, 4) МАР-65.
Каким образом достигается упорядоченная организация МТ? Могут быть разные объяснения: 1) МТ разной ориентации и расположения селективно стабилизируются. 2) После нуклеации, многие МТ открепляются от сайтов нуклеации и перемещаются по кортексу в ходе гибридного тредмиллинга. Общий результат – перемещение или транслокация МТ без участия моторных белков, просто за счет полимеризации-деполимеризации.
СЛАЙД - ПОСЛЕДСТВИЯ РАЗНЫХ ВАРИАНТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ СВОБОДНЫХ МТ В КОРТИКАЛЬНОЙ ЦИТОПЛАЗМЕ, из обзора Hashimoto, 2016. Во время гибридного тредмиллинга, МТ могут сталкиваться друг с другом под разными углами. Однако, столкновение под тупым (steep) углом способствует деплимеризации МТ, в то время как столкновение под острым (shallow) углом способствует формирование пучков Это простое правило взаимодействия МТ является важным в само-организации МТ в параллельно уложенные пучки. Последствия такого взаимодействия: если угол меньше 30о, то происходит преимущественное укладывание МТ в пучки, а если больше 40о – то процесс образования пучков менее эффективен. Как только МТ попала в пучок, она остается в его составе на продолжительное время, то есть, пучки являются позиционными и ориентационными «ловушками» для МТ. Оба процесса – миграция полимера и зависимое от угла взаимодействие МТ, которое ведет к формированию пучков, обеспечивают само-организацию полимера, и таким образом увеличивают упорядоченность систем на каждом локальном уровне. Безусловно, в формировании пучков МТ у растений ключевую роль играют МАР.
ФУНКЦИИ КОРТИКАЛЬНОЙ СЕТИ
Активно делящиеся растительные клетки, перед тем как они трансформируются в различные специализированные клеточные субпопуляции, активно растут. Эти клетки имеют клеточную стенку, состоящую из целлюлозы, гемицеллюлозы и других компонентов матрикса, поэтому упорядоченное формирование клеточной стенки и ее последующее разрыхление является необходимым для процесса направленного роста. Микрофибриллы целлюлозы, которые откладываются перпендикулярно оси роста клетки, играют важную роль в морфогенезе клеток. Поперечная ориентация микрофибрилл целлюлозы позволяет им направленно разрыхляться или разрежаться. В этом процессе активную роль играют ферменты экспансины.
Поперечная ориентация микрофибрилл целлюлозы контролируется кортикальными МТ, которые располагаются непосредственно под плазматической мембраной (гипотеза параллелизма МТ и микрофибрилл целлюлозы) - СЛАЙД. Эта гипотеза поддерживается двумя группами фактов. Во-первых, кортикальные МТ почти всегда расположены параллельно фибриллам целлюлозы. Во вторых, изменение ориентации МТ с помощью ингибиторов полимеризации вызывает изменения в ориентации фибрилл целлюлозы и ведет к неполяризованному росту клеток. Мультибелковый ферментный комплекс – целлюлоза-синтетаза, которая инкорпорирована в плазмалемму, может двигаться вдоль кортикальных МТ и использовать их как векторы для параллельного откладывания только что синтезированных микрофибрилл целлюлозы в клеточной стенке.
Дальнейшие исследования с использованием разных ингибиторов и мутантных клеток подтвердили гипотезу о направляющей роли МТ, но иногда ориентация МТ и микрофибрилл может быть не связанной, и микрофибриллы лежат параллельно друг другу в отсутствие интактных кортикальных пучков. Эти наблюдения указывают на то, что функции МТ в организации клеточной стенки, скорее всего, более сложные, чем простое соответствие (one-on-one guidance).
СЛАЙД -ОРГАНИЗАЦИЯ КОРТИКАЛЬНЫХ МИКРОТРУБОЧЕК (ЗЕЛЕНЫЕ) ОТРАЖАЕТ РАСПОЛОЖЕНИЕ МИКРОФИБРИЛЛ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ(РОЗОВЫЕ). Переход от хаотической организации к упорядоченной направляет поляризованный рост клеток.