Лекция. Особенности разного характера ферментации
(поверхностная, глубинная)
Периодическое культивирование включает стерилизацию сред и всего оборудования; загрузку биореактора питательной средой; внесение посевного материала (клеток или спор); выращивание культуры (это может совпадать во времени с последующим этапом или предшествовать ему); синтез целевого продукта; отделение и очистку готового продукта. Все этапы представлены во временном аспекте; после окончания последнего этапа производится мойка биореактора и подготовка его к новому циклу.
Если притока питательных веществ к растущим клеткам нет, а метаболические продукты не удаляются, то система считается закрытой и называется периодической. Рост периодической культуры характеризуется прохождением последовательных фаз: лаг-фазы, экспоненциальной (логарифмической), стационарной и фазы отмирания. Во время лаг-фазы клетки не размножаются, но адаптируются к новым условиям. Логарифмическая фаза характеризуется сбалансированные ростом, при котором удельная, скорость роста постоянна, а зависимость от времени выражается прямой линией. По мере истощения питательных веществ или аккумуляции продуктов метаболизма, ингибирующих рост, скорость роста понижается вплоть до нуля, когда культура переходит в стационарную фазу. Стационарная фаза — следствие равновесия между числом жизнеспособных и мертвых клеток. По мере уменьшения живых клеток и наступления лизиса культура переходит в фазу отмирания. Подъем кривой после фазы отмирания указывает на возможность критического роста, т. е. роста некоторых клеток за счет продуктов лизиса других клеток.
При периодическом способе культивирования ферментер заполняется исходной питательной средой и инокулятом микроорганизмов (Х 0 + S 0). В течение определенного периода времени в аппарате происходит взаимодействие микроорганизмов и субстрат сопровождающееся образованием в культуре продукта (Х + S → P).
Биохимические превращения в этом аппарате продолжаются от десятков часов до нескольких суток. Регуляция условий внутри ферментера – важнейшая задача периодического культивирования микроорганизмов. В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания. При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды. Целевые продукты образуются в экспоненциальной (первичные метаболиты – ферменты, аминокислоты, витамины) и стационарной (вторичные метаболиты – антибиотики) фазах, поэтому в зависимости от целей биотехнологического процесса в современных промышленных процессах применяют принцип дифференцированных режимов культивирования.
Первичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения, необходимые для роста микроорганизмов в качестве строительных блоков макромолекул, коферментов (аминокислоты, витамины, органические кислоты); вторичные метаболиты – это соединения, не требующиеся для роста микроорганизмов и не связанные с их ростом (антибиотики, алкалоиды, гормоны роста и токсины).
В результате этого создаются условия для максимальной продукции того или иного целевого продукта. Периодически ферментер опорожняют, производят выделение и очистку продукта, и начинается новый цикл.
По этому методу культуру микроорганизма выращивают на поверхности тонкого слоя жидкой или твердой среды. Жидкие питательные среды используются в основном при производстве органических кислот (лимонной, итаконовой), твердые — при производстве ферментов. В качестве продуцентов обычно применяются плесневые грибы рода Aspergillus.
НА АГАРИЗОВАННЫХ
Впервые агаризованные среды были использованы Робертом Кохом для изолирования отдельных клеток с целью получения чистых культур микроорганизмов. В качестве уплотняющих среду веществ применяют агар-агар, желатину, силикагель и др. Однако агар обладает рядом полезных свойств: он образует с водой гель, который плавится при 100° С, а затвердевает при 45° С; добавленные к агару при этой температуре термолабильные вещества и живые микроорганизмы не разрушаются; растворы агара не нуждаются в фильтрации, и др. Следует отметить, что агар, получаемый из различных видов морских водорослей, не является инертным материалом, а представляет собой сложный эфирный комплекс полисахарида и серной кислоты. Он содержит также микроэлементы, некоторые физиологически активные вещества и факторы роста, например тиамин. В промышленности метод поверхностного культивирования нашел применение в получении спорового материала для производства органических кислот с помощью плесневых грибов рода Aspergillus.
Метод поверхностного культивирования применяют для получения спорового материала (сухих конидий) плесневых грибов — продуцентов органических кислот (Aspergillus terreus — продуцент итаконовой кислоты).
1. Первая стадия размножения: конидии исходной культуры высеваются на жидкую модифицированную среду Мойера— Когхилла, в состав которой входят: лактоза, сахароза, некоторые минеральные соли, кукурузный экстракт. Колбы с посевом выдерживают в термокамере в течение 7 суток при 29°С. Затем в стерильных условиях отделяют конидии от мицелия и используют для дальнейшего размножения на агаризованной среде аналогичного состава. Среду наливают слоем в 1,8—2,0 см в 5—10 алюминиевых кювет с площадью дна 10—12 дм2. Кюветы с посевом выдерживают в течение 14 суток в термокамере при температуре 29 °С. По истечении этого срока конидии собирают и после микробиологического и биохимического контроля используют для второй стадии размножения.
2. Вторая стадия размножения: используют ту же среду, что и для первой стадии, аналогичны также условия выращивания и оптимальные параметры. Увеличивается только площадь посева, т. е. количество кювет, на которые высевают конидии первой стадии. После окончания цикла конидии собирают и смешивают с активированным углем для компенсации влаги.
Аналогично получают сухие конидии гриба Asp. niger для производства лимонной кислоты.
Выращивание посевного материала для производства антибиотиков осуществляется по иной схеме: исходным посевным материалом также является культура продуцента, выращенная на поверхности агаризованной среды (кроме того, применяют специальные среды из отрубей, зерен), а дальнейшие этапы выращивания осуществляются на жидкой среде в глубинных условиях культивирования.
Основой поверхностного метода производства ферментов являются твердые субстраты, получаемые при промышленной переработке продуктов сельского хозяйства, и отходы пищевых предприятий. Из числа этих субстратов наиболее широко применяются пшеничные отруби, свекловичный жом, различные жмыхи, картофельная мезга, выжимки плодов и овощей. Часто в твердую питательную среду кроме основного компонента (обычно — пшеничные отруби) вводят другой естественный материал, который содержит индуктор соответствующего фермента или улучшает структуру данной среды.
Методы культивирования на твердом субстрате делят на 2 группы: в тонком слое и при глубокой укладке. При тонкослойной технике субстрат укладывают толщиной от 2 до 4 см на металлическом или деревянном лотке и ведут культивирование в помещениях с кондиционированным воздухом. Образующееся растущей культурой тепло удаляют влажным воздухом. При технике глубокой укладки субстрат укладывают слоем 0,6 м или даже 1,5—1,8 м в емкость, имеющую прямоугольную или цилиндрическую форму. Заводы, использующие технику глубокой укладки, полностью автоматизированы (рис. 11). Для поверхностного культивирования применяют свекловичный и виноградный жом, зерновую шелуху, но чаще всего влажные пшеничные или рисовые отруби, к которым могут быть добавлены различные питательные соли; оптимальная влажность субстрата 40—70%. Стерилизуют обычно путем прямого введения пара в отруби, которые при этом перемешиваются. Если увлажнение отрубей проводят подкисленными раствора ми вместо воды, то стерилизация достигается за 15—30 мин при 95°. Иногда для обеззараживания применяют бактерицидные вещества, например, формальдегид, которые затем легко удаляются.
Рис. П. Поверхностное культивирование в лотках - 1 — отруби, 2 — разведенная кислота, 3 — запасной бункер, 4 — пар и охлаждение, 5 — помещение для культивирования, 6 — помещение для высушивания, 7 — дробилка, 8 — экстрактор, 9 —воздух, 10 — вентилятор
На рост и развитие гриба и биосинтез ферментов большое влияние оказывает структура среды, ее рыхлость, так как степень аэрации твердых сред обусловливается размером поверхности среды, находящейся в контакте с воздухом. Рост гриба может происходить только на поверхности твердых частиц среды. При недостаточной рыхлости среды ухудшается ее аэрирование, что неблагоприятно сказывается как на росте гриба, так и на биосинтезе ферментов.
При производстве ферментов особое внимание уделяется стерилизации твердых сред. Тепло в этих средах распространяется очень медленно. Наиболее распространена тепловая стерилизация острым паром при температуре 104—140°С. Длительность стерилизации предопределяется физико-химическими свойствами среды, обсемененностью микроорганизмами, объемом стерилизуемой массы и температурой острого пара. Для усиления эффекта стерилизации твердых сред пользуются соляной, серной и молочной кислотами, вводя их в среду до необходимого рН, или формалином в количестве 0,1—0,3% к массе отрубей.
Необходимым условием для роста продуцента и биосинтеза им ферментов при поверхностном культивировании на твердых средах является влажность среды – 58-60 %. При этом относительная влажность окружающего воздуха должна быть 98-100 %. Если влажность среды выше этого предела, особенно при выращивании культуры на открытых кюветах, создаются условия для возникновения бактериальной инфекции. При пониженной влажности среды грибы проявляют тенденцию к спорообразованию в ущерб синтезу ферментов. Поэтому при выращивании спороносящей культуры для использования в качестве посевного материала влажность среды поддерживается в пределах 40—45 %.
Поверхностный способ культивирования на жидких питательных средах в промышленных условиях широко применяется при получении органических кислот, в частности лимонной и итаконовой. В процессе культивирования плесневый гриб-кислотообразователь развивается на поверхности питательного раствора. Существенным недостатком поверхностного способа культивирования является то, что он требует больших производственных площадей. Кроме того, специфичность технологического оборудования затрудняет механизацию трудоемких работ и автоматизацию технологического процесса. Однако при сравнении технологии и экономики поверхностного и глубинного способов получения лимонной кислоты с производственной точки зрения предпочтительнее поверхностный способ, поскольку при его применении значительно ниже себестоимость продукта и меньше расход энергии.
При поверхностном культивировании на жидких средах различают следующие основные режимы ведения процесса: бессменный, бессменный с доливами и односменный. При бессменном методе культивирования гриба наибольшая эффективность использования бродильных площадей достигается при высоте слоя 12 см. Увеличение высоты слоя хотя и дает заметное повышение выхода кислоты с площади мицелия, но при этом наблюдается снижение выхода по углероду.
В результате изучения динамики кислотообразования доказано, что гриб сохраняет высокую активность продуцирования до самого конца цикла, поэтому цикл ферментации можно продлить, доливая питательный раствор или меняя его.
Особенность односменного метода заключается в том, что после слива основного раствора пленку гриба необходимо промыть стерильной водой и только после этого наливать новый питательный раствор. Наилучшие результаты достигаются при высоте слоя среды, наполовину меньшей, чем высота слоя первоначального раствора.
Лучшим способом удлинения цикла ферментации является долив. Вновь приготовленный питательный раствор в количестве 30-35 % начального объема следует доливать при содержании и остаточного сахара 3-4 %. Метод долива не дает резкого изменения состава среды под мицелием, концентрации сахара и кислоты. Продолжительность цикла ферментации увеличивается, и на 30% снижается объем работ по обработке камер, в связи с чем улучшается использование бродильной площади. Активность кислотообразования в момент долива нового раствора не снижается, как это происходит при односменном методе.
НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
В промышленных условиях непрерывный метод культивирования микроорганизмов — это огромный резерв повышения производительности. При использовании этого метода создаются постоянные условия внешней среды, которые можно поддерживать длительное время. При этом жизнь микробов продлевается, продуктивность культуры возрастает, производственный цикл значительно сокращается, облегчается регулирование параметров и, следовательно, управление процессом культивирования.
Метод проточного непрерывного культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Принцип проточного культивирования состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно вытекает такой же объем культуры. По такому принципу организуются две разновидности процессов непрерывного культивирования: процесс полного вытеснения и процесс полного смешения.
Непрерывные процессы имеют значительные преимущества перед периодическими: возможность специализации аппаратуры для каждой операции (стадии) непрерывного процесса, стабилизации его во времени, улучшение качества продукта, легкость регулировки и, главное, возможность автоматизации. Этими преимуществами объясняется тенденция микробиологов к переходу от периодических процессов к непрерывным.
Процесс полного вытеснения
Сосуд для выращивания микроорганизмов (трубчатый ферментер) представляет собой трубку, расположенную горизонтально или вертикально, в которую втекают среда и посевной материал и вытекает культура. Перемешивания не производится. Так можно культивировать микроорганизмы, не требующие аэрации. С одного конца ферментера подаются среда и посевной материал, популяция находится в начале своего развития. По ходу трубки культура «стареет», субстрат исчерпывается, накапливаются продукты метаболизма и вытекающая культура находится в состоянии, аналогичном стационарной фазе роста периодической культуры. Таким образом, в ферментере воспроизводится полная кривая роста, но не во времени, а в пространстве. В настоящее время появились ферментационные аппараты, обеспечивающие процессы с режимом, приближающимся к полному вытеснению и при аэробном культивировании. Это вращающиеся трубчатые реакторы с насадкой или внутренними аэрирующими элементами, а также многосекционные колонные аппараты.
Процесс полного вытеснения применяется в промышленности и тех случаях, когда желательно избежать потери времени на опорожнение, стерилизацию и заполнение емкости. Его применяют в пищевой промышленности, когда используются сложные среды и стоит задача наиболее экономично провести процесс, аналогичный тому, который ведется в периодическом режиме.
Пример практического применения трубчатого ферментера — анаэробная стадия при производстве пива в башенных проточных емкостях. В этом случае не требуется аэрирования и процесс идет без перемешивания. Если этот процесс аэробный, то его ведут в батарее аэрируемых ферментеров. При этом кривая роста периодической культуры распределяется по ходу батареи.