| Target gene Forward primer, reverse primer, and probe sequences (5′–3′) |
| wzyO1A CCTTTTGTATTTTCTTTCTGGCTAGTG CGAATATTTTATCCGATGGCTTT 6FAM]- AGTCCCGGTCATTGCTTATCGAACTGC-[BHQ1] |
| wzxO1non-A AATCATTTGATGTCGGCATGTC GATTTTTATACTTACATGGTGGATCGTATC [6FAM] -TCAGCTATACGCACTGGGCGTCCC-[BHQ1] |
| wzxO2 GCCAAGTGCAAAGTTTAATCACAAT CTTGCCAATTTTCCGCAGTATAT [6FAM]- CCTCTGCACCTGTAAGCACTGGCCTT-[BHQ1] |
| wzxO2-2 (CB11127) TCCGTTATATTTTGATGGCATTGA CCCTGTTACATTCCACCCTTCT [6FAM]-CAGCGCATTAGTTTTTCCACTTGCCTTG-[BHQ1] |
| wzxO2-3 (CB15123) CCACCACGGTGCACATTTAC GGACAGGTACAAAGCCTAATGAATATT [6FAM]-TTTCCCTTTACCTCCATCCCAATTTTCTGC-[BHQ1] |
| neuBK1 TCAATAGAACCTGATGAACTGAAACAT TCTGATCATTCTAGCGGGTTTTTATG [6FAM] –TTATTCCATAAGGCACCGCCGCAA – [BHQ1] |
ПЦР-детекция и картирование генов о-антигена E. Coli
Данные о нуклеотидных последовательностях получены из ранее опубликованной последовательности липополисахаридных антигенов О1 и О2 (Li et al., 2010) и капсульный антиген К1 (Lu et al., 2011) кодирующие гены были использованы для разработки зондов TaqMan ® qPCR для специфического обнаружения штаммов E. coli, кодирующих О1 -, О2-и К1-антигены. Как некоторые из исследованных О1 и О2 штаммов не реагировали с wzyO1A и wzxO2 кпцр анализы, нуклеотидные последовательности о-антигена гены, кодирующие белки из четырех количественной ПЦР-негативных штаммов О1 (А47, CB11070, CB13533, и CB14293) и две количественной ПЦР-отрицательные штаммы О2 (CB11127 и CB15123) были определены (см. ниже). Был разработан qPCR для варианта гена wzx, присутствующего в штаммах O1 CB13533 и CB14293, и использован для дальнейшего типирования коллекции штаммов E. coli O1. Аналогичным образом были разработаны и использованы два qpcr для варианта wzx генов CB11127 и CB15123 для молекулярного типирования E. штаммы coli O2 (таблица (табл. 1).1). Зонды qPCR реального времени и праймеры, используемые в данной работе, были разработаны с использованием программного обеспечения Primer Express V3. 0 (Applied Biosystems).
В режиме реального времени ПЦР проводили с ABI7500 инструмент (прикладные биосистемы, Фостер-Сити, Калифорния, США) в 25-мкл реакционного объема, легкий велосипедист 1536 (Рош Диагностика, Мелан, Франция) в 1,5-мкл реакционного объема или Биомарк (участвуйте, Южный Сан-Франциско, Калифорния, США) в nanofluidic формате в соответствии с рекомендациями поставщиков. Праймеры и зонды TaqMan использовались в конечной концентрации 300 Нм. Ко всем приборам применялся следующий двухэтапный тепловой профиль: активация фермента при 95°С в течение 1-10 мин (как рекомендуется в зависимости от используемого фермента), затем 40 циклов денатурации при 95°С и отжига при 60°С.
Заключение
Сравнительный анализ молекулярно-генетических систем E. Coli и других объектов позволил выявить многие гомологичные гены, оценить степень сходства геномов, а также высказать предположения о минимальной сложности гипотетической (а может быть, первичной?) клетки. Ясно, что для организации клетки необходим некоторый минимум молекулярных структур и процессов. Genitalium - 0.58 Мб, 470 генов. Путем сравнения геномов выявлено, что минимальная клетка, способная к автономной жизнедеятельности и самовоспроизведению, должна была бы содержать не менее 250-300 наиболее существенных генов. Группа японских исследователей [7] показала, что можно обеспечить все основные метаболические потребности клетки, трансляцию и репликацию РНК-генома в системе со 127 генами. Правда, при этом клетка должна быть лишена архива ДНК, репарационных и других важных систем защиты и помехоустойчивости, что делает ее эволюционно беззащитной.
Литература
1. Ратнер В.А. Концепция молекулярно-генети-ческих систем управления. Новосибирск: Наука, 1993. 120 с.
2. Ratner V.A., Zharkikh A.A., Kolchanov N.A. et al. Molecular Evolution. Berlin e.a.: Springer-Verlag, 1996. 433 p.
3. Сайт в INTERNET: https://ncbi.nlm.nih.gov/genbank/genomes.
4. Blattner F.R., Plunket III.G., Bloch C.A. et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K12 // Science. 1997. V. 277. P. 1453-1462.
5. Karp P.D., Riley M. EcoCyc: encyclo- pedia of E. coli genes and metabolism. https://ecocyc.PangeaSystems.com/ecocyc/ecocyc.html.
6. Ратнер В.А. Молекулярная генетика: принципы и механизмы. Новосибирск: Наука, 1983. 256 c.
7. Tomita M. et al. A virtual cell with 127 genes // Proc. 1st Intern. Conf. "Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS'98)", Novosibirsk: Inst. Cytol. Genet., 1998. V. 1. P. 97-99.
8. haracterization of FosL1, a Plasmid-Encoded Fosfomycin Resistance Protein Identified in Escherichia coli. Kieffer N, et al. Antimicrob Agents Chemother 2020 Mar 24.
9. Differential dynamics and impacts of prophages and plasmids on the pangenome and virulence factor repertoires of Shiga toxin-producing Escherichia coli O145:H28. Nakamura K, et al. Microb Genom 2020 Jan.
10. McClung D.J., Calixto A., Mosera M.N., Kumar R., Neidle E.L., Elliott K.T. Novel heterologous bacterial system reveals enhanced susceptibility to DNA damage mediated by yqgF, a nearly ubiquitous and often essential gene. Microbiology. 2016;162:1808–1821. [PubMed] [Google Scholar]
11. Keseler I.M., Mackie A., Peralta-Gil M., Santos-Zavaleta A., Gama-Castro S., Bonavides-Martinez C., Fulcher C., Huerta A.M., Kothari A., Krummenacker M., et al. EcoCyc: fusing model organism databases with systems biology. Nucleic Acids Res. 2013;41:D605–D612. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
12. Karp P.D., Weaver D., Paley S., Fulcher C., Kubo A., Kothari A., Krummenacker M., Subhraveti P., Weerasinghe D., Gama-Castro S., et al. The EcoCyc database. EcoSal Plus. 2014;2014 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
13. Weaver D.S., Keseler I.M., Mackie A., Paulsen I.T., Karp P.D. A genome-scale metabolic flux model of Escherichia coli K-12 derived from the EcoCyc database. BMC Syst. Biol. 2014;8:79. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]