Лейкоцитарная формула – это процентное соотношение различных видов лейкоцитов. Подсчитывается при микроскопии окрашенных мазков крови или в гематологических анализаторах.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАЗКОВ
Мазки крови готовят на предметных стеклах, которые предварительно моют и обезжиривают.
Подготовка стекол. Стекла (новые и бывшие в употреблении) замачивают на 8-10 часов в 2% растворе хозяйственного мыла или СМС в эмалированной посуде, кипятят в этом же растворе 5-10 минут. Более длительное кипячение и использование алюминиевой посуды не рекомендуется, так как приводит к помутнению стекол. Промывают стекла в проточной воде, насухо вытирают и помещают для обезжиривания на 30-60 минут в смесь Никифорова (спирт 96% и диэтиловый эфир в соотношении 1:1). Насухо вытирают чистой тканью и хранят в закрытой чистой посуде.
Приготовление мазков. Мазок крови делается с помощью шлифованного стекла с идеально ровным краем, ширина которого должна быть на 2-3мм меньше, чем у предметного стекла. После прокола пальца первую каплю удаляют сухим ватным тампоном. К куполу следующей капли прикасаются предметным стеклом на расстоянии 1,5-2см от края стекла. К коже в месте прокола не прикасаться! Капля крови на предметном стекле должна иметь диаметр 2-3мм. Шлифованное стекло ставят под углом 45º на 1-2мм перед каплей и двигают его назад к капле так, чтобы вся кровь растеклась по краю шлифованного стекла. Быстрым легким движением делают мазок, пока не кончится вся капля крови. Высушивают мазки на воздухе. Маркируют их простым карандашом, обозначая на толстой части мазка фамилию и инициалы пациента или его регистрационный номер. Делают не менее двух мазков.
Требования к мазку. Правильно приготовленный мазок должен быть:
- равномерной толщины, полупрозрачным, желтоватого цвета;
- достаточной величины – занимать ½ - ¾ длины предметного стекла, отступив от края на 1-1,5см;
- оканчиваться «метелочкой».
Толстые мазки для исследования не пригодны, так как клетки в них располагаются в несколько слоев и деформируются. В правильно приготовленных тонких мазках клетки располагаются в один слой.
ОКРАСКА МАЗКОВ
Готовые высушенные мазки крови фиксируют, а затем окрашивают. В неокрашенном виде мазки сохраняются при комнатной температуре в течение 3 дней.
Фиксация мазков предохраняет элементы крови от воздействия содержащейся в красках воды, под влиянием которой в нефиксированных мазках происходит разрушение эритроцитов и изменяется морфология лейкоцитов. Фиксация также вызывает коагуляцию белков и закрепляет мазок на стекле. Фиксацию проводят либо в специальной кювете, либо в широкогорлой банке с хорошо закрывающейся крышкой.
Для фиксации используют следующие реактивы:
- метиловый спирт – время фиксации 3-5 минут;
- раствор эозинметиленового синего по Май-Грюнвальду (фиксация 3 минуты);
- этиловый спирт (фиксация 20-25 минут);
- смесь Никифорова (фиксация 30 минут).
Фиксированные мазки высушивают на воздухе и окрашивают.
Окраска мазков. Проводится в специальных кюветах или на «мостике». В качестве унифицированных приняты 3 метода окраски мазков крови:
- по Романовскому-Гимзе;
- по Нохту;
- по Паппенгейму.
Принцип окраски мазков крови. Основу современных методов окраски клеток крови заложил русский врач Д.Л. Романовский, который в конце 19 века предложил окрашивать препараты одновременно двумя красителями – щелочной и кислой реакции. Различные клеточные структуры имеют разную рН и связываются с красителем противоположной реакции. Ядра клеток богаты нуклеиновыми кислотами, имеют кислую реакцию и окрашиваются красителями щелочной реакции (метиленовым синим, азуром I и II) в сине-фиолетовый цвет. Цитоплазма гранулоцитов, зернистость эозинофилов, эритроциты содержат щелочные белки, поэтому окрашиваются красителем кислой реакции (эозином) в розовый цвет.
Окраска по Романовскому-Гимзе
Реактив: готовая краска Романовского. В её состав входит азур-II (смесь равных частей азура-I и метиленового синего) и эозин. Заводская краска очень концентрированная и перед употреблением её нужно разводить. Степень разведения и время окраски определяется опытным путем и называется титрование краски Романовского.
Титрование краски Романовского. Готовят три разведения краски из расчета: 1, 2 и 3 капли красителя на 1мл дистиллированной воды. Каждым из разведений окрашивают 5 зафиксированных мазков в течение 20, 25, 30, 35 и 40 минут. На каждом мазке отмечают время окраски и разведение красителя. После окрашивания микроскопируют мазки и определяют разведение и время, при которых получена наилучшая окраска. Эти условия, соответствующие лучшему окрашиванию, указывают на этикетке бутыли с краской. Например: титр краски – 1капля/мл; экспозиция – 30 минут. Титрование краски Романовского проводят один раз перед использованием каждой новой партии красителя.
Ход окраски. В специальную кювету для окрашивания наливают раствор краски Романовского, приготовленный непосредственно перед использованием в соответствии с установленным титром. В рабочий раствор красителя опускают штатив с сухими фиксированными мазками. Красят мазки в соответствии с выбранной экспозицией. Промывают мазки проточной водой и высушивают на воздухе.
Окраска по Нохту
Реактивы.
1. Основной раствор азура II (1г на 1л дистиллированной воды).
2. Основной раствор эозина калия (1г на 1л дистиллированной воды). Красители нуждаются в вызревании в течение 2 недель в темном месте при периодическом помешивании.
3. Фосфатный буфер с рН 7,4-7,5.
4. Рабочий раствор азур-эозина готовят перед употреблением путем смешивания 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора эозина К и 55 мл буферного раствора.
Ход окраски. Окраску производят так же, как методом Романовского – в кюветах с помощью свежеприготовленного рабочего раствора азур-эозина в течение 20-45 минут. Пропорции красителей и время окраски устанавливаются опытным путем для каждой партии красителя.
Окраска по Паппенгейму
Реактивы.
1. Готовый краситель-фиксатор Май-Грюнвальда (1г эозинметиленового синего растворяют в 1л метилового спирта).
2. Свежеприготовленный раствор краски Романовского или рабочий раствор азур-эозина по Нохту.
Ход окраски. Мазки не нуждаются в предварительной фиксации, так как краска Май-Грюнвальда, приготовленная на метиловом спирте, одновременно и фиксирует, и красит мазок. На нефиксированный мазок наносят 2 мл красителя-фиксатора Май-Грюнвальда на 3 минуты. Доливают столько же (2 мл) дистиллированной воды и выдерживают 1 минуту. Краску сливают, промывают мазки водопроводной водой. Докрашивают мазки рабочим раствором азур-эозина по Нохту или разведенной краской Романовского в течение 8-15 минут. Время окрашивания устанавливают опытным путем для каждой новой партии красителя. Промывают мазки водой и высушивают на воздухе.