«Aspergillus является одним из самых древних родов грибов, известных человеку. К 1926 году представители этого рода стали самыми детально изученными плесенями в мире. Их преобладание в природе, простота культивирования в лабораторных условиях и экономическая значимость некоторых видов обеспечило пристальное внимание со стороны микологов и ученых, задействованных в производстве. Эти грибы широко распространены как сапрофиты, растущие на разлагающихся растениях и могут быть найдены на заплесневелом сене, кучи органического компоста и т.п. Большинство видов адаптировано к питанию путем расщепления сложных растительных полимеров, но они также способны к использованию в качестве субстратов навоза, человеческих тканей и древних пергаментов. Существуют сведения о возможности неидентифицированного вида Aspergillus к солюбилизации низкокалорийного угля.
Плесневые грибы этого рода задействованы в ряде производств, таких как производство энзимов, производство химикатов и пищевое производство. Также, в классической генетики грибов, вид Aspergillus (Emericella) nidulans был использован для объяснения парасексуального процесса, создания концептов регуляция метаболических путей, цикла клетка, сплайсинга интронов и полярности гифов. Некоторые же виды заражают зерно и пищу в целом токсичными метаболитами, что является угрозой для здоровья людей и животных. Определенные виды напрямую заражают человека, вызывая как локализованные, так и систематические инфекции, особенно подвержены этому люди с ослабленным иммунитетом.
Физиология и экология. Споры Aspergillus часто встречаются в аэрозолях, в которых они дрейфуют в воздушных потоках, перенося себя на короткие, либо на дальние расстояния, в зависимости от условий окружающей среды. Как только споры входят в контакт с поверхностью, они готовы к прорастанию, при условии, что влажность находится на нужном уровне. Возможность разноситься по воздуху на любые расстояния и расти практически везде, где есть подходящий источник пищи и воды, означает, что «вездесущий» одно из тех слов, что максимально характеризуют эти плесневые грибы.
Одна из ключевых особенностей всего царства грибов это их характерный способ питания. Эти организмы секретируют кислоты и энзимы в окружающую среду, разрушая полимерные молекулы до более простых, которые в свою очередь абсорбируются в грибную клетку. Грибы, как и животные, являются гетеротрофами. Но в то время как животные сперва едят свою пищу, и затем переваривают ее, грибы предварительно переваривают питательные вещества, а лишь после этого поглощают их. Доступу к питательным веществам также способствуют механические воздействия, посредством которых концы гифов грибов прорастают сквозь субстрат. Виды Aspergillus являются типичным примерами грибного типа жизни. Чаще всего представителей можно обнаружить в наземной среде обитания, отделенными от почвы, но в ассоциации с мертвым покровом. Процесс разложения, выполняемый этими плесенями, играет важнейшую роль в природном обороте элементов, в частности, в углеродном цикле, где эти самые плесени восполняют запасы диоксида углерода. В экосистеме консорциумы организмов из различных царств поглащают субстраты с разной интенсивностью. Aspergillus и другие плесневые грибы играют ключевую роль в таких консорциумах, т.к. плесени являются «знатоками» в переработке крахмала, гемицеллюлозы, целлюлозы, пектинов, и других углеводных полимеров. Отдельные виды способны разлагать менее податливые вещества: животные и растительные жиры, хитин, кератин. Для достижения максимальной эффективности разложения необходим достаток азота, фосфора и других неотъемлемых неорганических веществ. В ходе разложения выделяются вещества, которые служат пищей для многочисленных почвенных организмов. Процесс, при котором плесени разлагают субстраты, изготовленные человеком, называется биодетериорация. И бумага, и текстиль (хлопок, джут, лен) особенно восприимчивы к Aspergillus. Подобным образом, еда, потребляемая людьми и животными, является едой и для плесеней. Такие слова как разложение, гниение, порча используются для описания процессов использования такими грибами продуктов питания. Эти процессы могут происходить в поле перед сбором урожая, во время хранения и после коммерческой обработки или приготовления дома. И несмотря на то, что продукты питания с низким значением pH, низким содержанием влаги и высоким осмотическим давлением благодаря соли либо же сахару обычно не поддерживают рост бактерий, многие представители рода Aspergillus способны расти на таких продуктах с низкой активностью воды». [9]
Идентификация и внутриродовые категории. Отличительной
чертой всего рода Aspergillus является конструкция, несущая споры. Это самая важная микроскопическая характеристика, использующаяся в таксономии Aspergillus. Во время дифференциации мицелия отдельные клетки увеличиваются в размерах, образуя жесткую клеточную стенку и формируя T- или L- образные опорные клетки, которые затем продуцируют конидионосец, перпендикулярный длинной оси клетки. Иногда распознать такую опорную клетку может быть затруднительно, но если это удается, то морфологист может быть уверен в том, что исследуемый объект принадлежит к роду Aspergillus. Конидионосец расширяется у своего апекса, формируя округлую, эллипсовидную или булавовидную везикулу. Из плодородной зоны везикулы вырастает слой клеток, известных как фиалиды. Они в свою очередь продуцируют длинные цепи митозных спор, названных конидиоспорами. Размер и расположение фиалид, а также цвет конидиоспор - очень важные признаки идентификации. Например, особи вида Aspergillus niger несут черные споры, A. ochraceus -от желтого до коричневого, а A. fumigatus, A.nidulans, A. flavus - зеленые.
Главные отличительные особенности видов при исследовании культуры - цвет колонии, темп роста и термотолерантность. В виду того, что разные виды Aspergillus проявляютразные морфологические и ростовые реакции на различные составы питательных сред, существует необходимость в стандартизации условий культивирования, поэтому правильное распознавание видов зависит от среды, на которой производилось выращивание. Во времена послепастеровской эры для культивирования плесневых грибов Aspergillus применялась питательная среда имени немецкого ученого чешского происхождения Фридриха Чапека, т.н. агар Чапека. В состав данной среды входила сахароза в качестве источника углерода и нитраты в качестве источников азота. Штамм-вариация довольно обширна внутри видов и большое количество едва различимых эффектов среды, таких как воздушный обмен, освещенность и объем могут влиять на морфологию. Современные таксономисты обычно применяют разнообразные питательные среды и разнообразные температуры.
Вдобавок к конидионосцам, другие морфологические структуры, служающие для идентификации вида, включают в себя клейстотеций (аскокарп круглой формы), склероций и клетки Hülle. И клейстотеций, и склероций являются круглыми закрытыми структурами и обычно их размер достигает макового зерна. Их может быть настолько много, что они могут доминировать над самой колонией. Клейстотеций - стадия полового размножения, содержащая в себе аскоспоры, прошедшие мейоз. Эти аскоспоры находятся внутри аски. В ранних источниках клейстотеций известен как перитеций, в настоящий момент последний термин употребляется в отношении плодовых тел, открытых с одной стороны, а не полностью закрытых, как клейстотеции. Более того, существует апотеции - полностью открытый тип аскокарпа. Клетки Hülle это утолщенные, чаще всего имеющие форму глобулы, клетки, соединенные с клейстотециумом. Склероциум - округленная масса мицелия, покрытая снаружи слоем меланина. Макроскопически склероциум напоминает клейстотециум, но не содержит в себе половые споры. Основное назначение склероциума – служить в качестве временной формы существования плесени, призванной сохранить организм во время неблагоприятных условий окружающей среды. В последнюю очередь, но не по значимости стоит отнести тот факт, что некоторые таксономисты в дополнение ко всем вышеперечисленным признакам относят биохимические характеристики, такие как производство вторичных метаболитов или ультрамикроскопические черты, такие как рисунки на спорах. Морфология клейстотеция, перитеция и апотеция представлены на рисунке 13.
Рис.13. Виды аскокарпов
В XX веке, по ходу того, как микологи изолировали и идентифицировали все большее число образцов, количество известных видов Aspergillus росло. Это повлекло за собой появление морфологически отличных кластеров, поэтому с целью облегчить идентификацию род был разделен на внутриродовые группы. Например, группа Aspergillus glaucus характеризовалась многочисленными, зелеными верхушками конидий, и в большинстве случаев с присутствующим перитецием, в то время как группа Aspergillus ochraceous имела желтые конидии и многочисленный склероциум от кремового до пурпурного цвета. К сожалению, термин «группа» не имеет номенклатурного статуса в составе формальных правил биологической номенклатуры. Род был пересмотрен с применением новой таксономической иерархии, основанной на секциях. В этой системе, подрод Aspergillus состоял из ксерофильных видов. A. glaucus - типовой вид, классифицируемый в подроде Aspergillus, секции Aspergillus. Новый подрод был представлен под названием Circumdata, который содержал в себе семь секций, среди которых «секция circumdati» являлась новым наименованием для старой группы Aspergillus ochraceous. Попытка наложения подродовых эпитетов, единственный из которых назывался Aspergillus не прижилась в силу своей чрезмерной запутанности. С другой стороны, большинство современных таксономистов в отношении внутриродовых классификаций Aspergillus предпочитают понятие «секция» в угоду «группе».
Номенклатура. Плесени, продуцирующие бесполые споры, подходящие под описание спор Aspergillus группируются в род Aspergillus. Существует около 250 видов в этому роду и это число, вероятно, значительно увеличится в ближайшем будущем благодаря повышению использования филогенетического концепта, основанного на данных, полученных путем изучения последовательности ДНК, а не на основании привычных морфологических данных.
За исключением ископаемых, грибы являются единственными организмами, названия которых отклоняются от базовых правил биологической номенклатуры, а именно от правила, согласно которому, каждая таксономическая группа может иметь одно единственное верное название. С 1905 Ботанический свод законов (который был ответственен за названия растений и грибов) вынес постановление, позволяющее организму из царства грибов иметь два разных имени - одно для половой, и одно для бесполой стадий. Например, следуя этим правилам, Aspergillus nidulans, хорошая известная модель в генетике, должна иметь второе название Emericella nidulans,что и зафиксировано в базе данных GenBank. Тем не менее, в профессиональной среде большей популярностью пользуется название Aspergillus nidulans. Запрос в Google данного организма под именем «Aspergillus nidulans »выдает 725,000 результатов, в то время как «Emericella nidulans » выдает менее 60,000 результатов.
Некоторые виды Aspergillus регулярно производят и половые, и бесполые споры, другие же очень редко претерпевают половую стадию, а третьи не предусматривают такую стадию вовсе.
Первичные и вторичные метаболиты. Виды внутри рода Aspergillus отличаются широким спектром производимых соединений. Соединения, которые имеют товарное значение включают в себя лимонную, глюконовую, итаконовую и койиновую кислоты. Использование Aspergillus niger в производстве лимонной кислоты началось еще в 1917 году. Лимонная кислота - один из самый используемых ингредиентов в пищевой промышленности. Также кислота нашла свое применение в фармацевтической и косметических индустриях как подкислитель и как вещество, помогающее растворять активные ингредиенты. Другие способы применения вещества включают в себя использование в качестве отвердителя в клеях и замедлителя застывания бетона. Лимонная кислота по праву может считаться одним из мастодонтов химической промышленности - ее синтез насчитывает 1.6 миллиарда килограмм продукта ежегодно. Помимо лимонной кислоты A. niger также нашли применение в синтезировании глюконовой кислоты, которая применяется как добавка в чистящие средства по металлу, и для лечения дефицита кальция и железа в организме человека.Из A. terreus получают итаконовую кислоту, которая является ничем иным, как синтетическим полимером. A. oryzae ферментирует койиновую кислоту, являющуюся важным компонентом отбеливателей кожи, а также необходима для синтеза усилителей вкуса.
Что касается вторичных метаболитов, то некоторые из них так же ценны, как и первичные. Самыми прибыльными из них считаются статины и их производные. Эти вещества, способные понижать уровень холестерола, находятся среди самых используемых лекарств во всем мире. Первый статин, мевастатин, был получен в Японии от Penicillium citrinum. Первый же статин, получивший одобрение к использованию человеком, стал ловастатин. Он был изолирован из клеток Aspergillus terreus. Из всего вышесказанного заключено, что статины - семейство полезных, биологически-активных вторичных метаболитов, полученных от представителей рода Aspergillus. Среди других вторичных метаболитов находятся антагонисты холецистокинина и нейрокинина, противогрибные лекарства и множество других веществ.
Пищевое ферментирование. Энзимы. Пищевое ферментирование - древний процесс, вовлекающий микроорганизмы и их энезимы для увеличения рациона питания человека. Ферментированная еда имеет более долгий срок хранения, усиленные вкусы, текстуры, ароматы, и может иметь превосходящие обычную пищу физиологические свойства, такие как улучшенная перевариваемость. Для веганов такая ферментированная еда служит вкусным и богатым белком заменителем мяса.
Азиатская кухня высоко полагается на различные виды ферментированной пищи. В частности, Aspergillus oryzae и A. sojae используются во многих случаях. Также они известны под именем койи-плесени. Их гидролитические энзимы позволяют им расти на крахмале и других субстратах, богатых углеводами. В процессе производства койиновой кислоты энзимы грибов выполняют те же функции, что и солодовые энзимы в производстве пива. Койи-плесени выделяют амилазы, расщепляющие рисовый крахмал, который в свою очередь может подлежать дальнейшей ферментации для создания рисового вина. Ферментированные напитки из риса имеют множество локальных названий, в зависимости от места происхождения. В Китае рисовое вино называется Шаосин, Саке в Японии, Якчу или Такчи в Южной Корее, и другие по всей Азии. Другое эффективное применение койи-плесени нашли в ферментировании различных бобовых культур, самым известным продуктом которого считается соевый соус. Соевый соус - соленоватая жидкость с сильным вкусом, приготовленная из соевых бобов, ферментированных койи-плесенями, дрожжами и некоторыми галофильными бактериями. В Китае соевый соус называется Цзянъю, макьян и каниян в Южной Корее, тойо на Филиппинах и сииу в Таиланде.
Первый патент на очищенный энзим был выдан в 1894 году. Были открыты компании в Нью-Джерси и Нью-Йорке для производства энзимов из Aspergillus и продажи их оптом. Современная коммерческая энзимология это процветающий бизнес, в котором A. niger и A. oryzae находятся на первых местах среди главных продуцентов гидролитических энзимов. Будучи организмами с высокой секретирующей способностью, их внеклеточные энзимы с легкостью могут эксплуатироваться в печении, производстве алкогольных и безалкогольных напитков, животных кормов, бумажной промышленности. A. niger очень популярен как эффективный производитель гетерологичных белков с помощью технологий генной инженерии.
Современная биотехнология рассматривает новые и более экстенсивные методы использования грибных энзимов, потому что эксперты в вопросах энергии сейчас сфокусированы на «зеленых» методах трансформирования биомассы. В теории, биомасса, полученная от растений, может заменить нефтехимическое сырье в определенных химических процессах. Плесени выделяют множество энзимов, превращающих комплексные полимеры в углеводы, жиры и другие простые молекулы, которые могут быть использованы для синтеза топлива и химикатов.
Aspergillus и болезни. Споры Aspergillus в составе аэрозолей могут быть обнаружены практически везде, поэтому факт их контактирования с людьми является обыденностью. Такое контактирование является рутиной для организма человека и обычно не влечет за собой негативных последствий для здоровья. Однако Aspergillus может и вызывает болезни животных и человека, которые можно отнести к трем главным группам: Продуцирование микотоксинов, вызывание аллергических реакций, локальные и систематические инфекции. В вопросе последних двух ключевую роль играет иммунный статус человека, подвергшегося воздействию.
Аллергические реакции. Аллергия и астма считаются ответом иммунной системы на присутствие спор или гифов грибов. В противоположность этому, при инвазивном аспергиллезе иммунная система подавляется и может защитить организм очень ограничено, либо не может вовсе.
Атопия - генетическая предрасположенность человека к развитию гиперчувствительности определенной степени, проявляющейся астмой, сенной лихорадкой (аллергический ринит) и аллергиями на пищу. Аллергические реакции у индивидуумов с атопией могут быть вызваны спорами, вдыхаемыми с воздухом или же непосредственно с грибами, проглатываемыми с пищей. Находящиеся в воздухе споры без труда вдыхаются человеком во время дыхания. Также они вступают в контакт с глазами и другими открытыми участками тела. Плесневые грибы вовлечены в инициацию и обострение болезней нижних дыхательных путей, таких как астма, хотя этиология болезни не изучена до конца.
Объем вдыхаемых спор крайне разнится в зависимости от условий окружающей среды. Определенный условия, такие как компостные кучи и амбары, содержат необычайно высокий уровень концентрации спор. Такого массивного воздействия следует избегать, независимо от того, предрасположен ли индивид к аллергическим реакциям, ведь продолжительный контакт с высокой концентрацией плесневых спор может вылиться в аллергический альвеолит, при котором возникает лимфоцито-направленная гиперчувствительность. Внешние аллергические альвеолиты не ограничены спорами Aspergillus или других микроскопических грибов. Они могут быть вызваны вдыханием т.н. антигенной пыли. Такая пыль редко, если вообще состоит из одной органической субстанции. Чаще всего она представлена смесью грибных спор, спор актиномицетов, животных протеинов и т.д. Профессиональные микозы - формы внешних аллергических альволитов. Все они являются воспалительными реакциями, вызванными вдыханием высокой концентрации спор микроскопических грибов и других антигенных агентов. Некоторые формы этих недостаточно определенных болезней человека в особенности связны с воздействием высоких концентраций спор Aspergillus, включая такие болезни как легкое фермера, легкое работающих с солодом, легкое любителей птиц. Легкое работающих с солодом, самое изученное из них, это профессиональное заболевание индивида, вовлеченного в процесс пивоварения, коррелированное с вдыхаемыми спорами Aspergillus clavatus и A. fumigates из загрязненного ячменя.
Микотоксины. В агрокультурных кругах, Aspergillus изначально воспринимался как серьезная проблема в силу вызываемой биодетериорации хранимых урожаев, и в силу своей возможности выступать оппортунистическим патогеном посевов, особенно в условиях с высокой влажностью. Открытие афлотоксинов в 1960-е, связанное с гибелью большого числа домашней птицы, форели и других одомашненных животных по всему миру, привело к понимаю людьми того, что эти микроскопические грибы несут угрозу помимо порчи продуктов. Исследования афлотоксинов ознаменовали собой т.н. «золотую эру» исследований микотоксинов, во время которой было обнаружено множество токсинов, производимых как Aspergillus, так и другими родами отдела. В дополнение к афлотоксину, другими важными микотоксинами, производимыми Aspergillus, являются охратоксин, патулин и фумагиллин.
Афлотоксины до сих пор расцениваются как самые важные микотоксины. Они синтезируются лишь парой видов Aspergillus, среди которых A. flavus и A. parasiticus - самые проблематичные. На проявление болезней, связанных с афлотоксинами, влияние оказывают такие факторы, как возраст, питание, пол, одновременное подверженность другим токсинам. Целевой орган в млекопитающих, поражаемый афлотоксинами, это печень, поэтому афлотоксикозы преимущественно гепатальные болезни. Среди условий, способствующих заболеванию афлотоксикозом находятся ограниченность пищи, условия, способствующие развитию плесени на продуктах пищи и недостаток регуляторных систем мониторинга и контроля афлотоксинов.
Афлотоксины были изолированы из образцов главных зерновых культур и таких разнообразных источников, как арахисовое масло и марихуана. Повседневные продукты питания, регулярно зараженные афлотоксином: кассава, чили, кукуруза, семена хлопка, просо, арахис, рис, сорго, семена подсолнуха, лесные орехи, пшеница и другие. При обработке, афлотоксины попадают в продовольственные товары, будь то пища, предназначенная для человека, или корм для животного. Продукты трансформации афлотоксинов иногда могут быть обнаружены в яйцах, молочных продуктах и мясе, в случае употребления животным зараженных кормов.
Подверженность человека афлотоксинам трудно избежать из-за того, что A. flavus агрессивно растет на многих продуктах на всех стадиях пищевой цепи: в поле, в хранилище, дома. Данные об острых формах афлотоксикоза поступают из ряда развивающихся стран, например из Индии и Тайланда. Симптомы включают в себя отек, геморрагический некроз печени и глубокая летаргия. Более того, афлотоксины являются сильнодействующими канцерогенами, в особенности афлотоксин B1. Основываясь на эпидемиологических исследованиях в Азии и Африке, Международное агентство по изучению рака в 1988 году поместило афлотоксин B1 в список канцерогенов человека. В развивающихся странах, акцент в исключении афлотоксинов из пищевой цепи сделан на его канцерогенных свойствах. Жесткие правила регулирования (4-30* 10−9) были установлены для ряда продуктов питания.
Инфекции. Aspergillus fumigatus и другие виды, способные расти при температуре 37°C являются оппортунистическими патогенными микроорганизмами. О 40 видов из 250 были получены сведения, в которых сказано, что они являются патогенными для человек, но большинство же случаев заболевания связаны лишь с одним видом, A. fumigatus. Дыхательная система человека - естественный вход для этого организма. Как известно, все болезни животных и человека, вызываемых Aspergillus, собраны под общим названием аспергиллезы, что является обширным термином с соответствующим количеством связанной литературы. Степени заболеваний также разнятся - от локальных и незначительных недугов до системных осложнений, угрожающих жизни. Несмотря на то, что аспергиллезы не являются болезнями, передающимися от носителя к здоровому организму, современная медицина и наука уделяют огромное внимание данному типу болезней. Помимо человека случаи аспергиллеза регулярно наблюдаются у домашних и диких животных. Особенно высокую восприимчивость к аспергиллезам демонстрируют птицы и следуя истории, впервые этот вид заболеваний считался птичьим.
Различные формы аспергиллезов включают в себя тяжелую астму с сенсибилизацией к плесневым грибам; аспергиллома, при которой плесень колонизируется, вызывая гранулематозное поражение легких; систематический (инвазивный) аспергиллез, который отличается распространением плесневого гриба по всему телу. И аспергиллома, и инвазивный аспергиллез включают в себя прямое разрастание плесени на тканях носителя. Первое чаще всего сопровождается туберкулезом и считается полу-инвазивным. Что касается инвазивного аспергиллеза, то он признан самой опасной формой аспергиллеза из всех инфекций, вызываемых Aspergillus. Клиническая категоризация этих условий не поддается четкой классификации, но представляет хорошую основу для понятия аспергиллеза. Несмотря на продвижения в лекарственной терапии против плесневых грибов, инвазивные формы аспергиллеза имеют необычайно высокие показатели смертности.
Клинические проявления и тяжесть аспергиллеза отражают иммунологический статус пациента. Лучшая защита это крепкая иммунная система. Распространение Aspergillus в организме говорит об отказе, либо пробелах в защитных системах носителя. Иммуносупрессоры и другие виды лекарств создали экологическую нишу в виде людей с ослабленным иммунитетом для Aspergillus, которые могут вызывать у таких людей серьезные и часто фатальные инфекции. Реципиенты костного мозга составляют особенно уязвимую часть населения. К сожалению, резистентность ко многим препаратам, направленных против плесневых грибов, становится все более распространена, и т.к. болезнь становится все более превалирующей, то существует необходимость в открытии новых и эффективных лекарствах.
Постановление диагноза инвазивного аспергиллеза на ранней стадии все еще очень затруднено. Чаще всего для этого изолируется и в последующем идентифицируется образец, взятый от пациента, а также взятие биопсии тканей с целью обнаружить характерные септированные гифы. В реальности же аспергиллез обнаруживается чаще всего лишь на стадии некроза. Другая растущая проблема связана с увеличением числа видов, ответственных за инвазивный аспергиллез в трансплантированных органах.
Инфекции Aspergillus не похожи на классические бактериальные инфекции. Большинство патогенов-бактерий эволюционировало так, чтобы иметь возможность подавить функции хозяин, к тому же эти патогены обладают особенными факторами вирулентности, незаменимыми в проведении взаимодействий между хозяином и патогеном. У A. fumigatus, в свою очередь, нет очевидной нужды в нахождении внутри человека либо животного. Тот факт, что Aspergillus может стать смертельным патогеном, является лишь случайностью, связанной с крайней степенью оппортунизма. В случае инвазивного аспергиллеза единственный элемент, имеющий значение - иммунологический статус хозяина, а не вирулентность плесневого гриба.
2. МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ.