Микробиология Туберкулёза. Видовое название возбудителя и его систематическое положение.. Морфологические свойства.

Микробиология Туберкулёза

Видовое название возбудителя и его систематическое положение.

M. tuberculosis. Род Mycobacterium относится к семейству Mycobacteriaceae.

Морфологические свойства.

М. tuberculosis имеет форму тонких, стройных, коротких или длинных, прямых или искривленных палочек, длиной 1,0-4,0 мкм и диаметром 0,3-0,6 мкм. Непо­движны, спор и капсул не образуют. В старых культурах наблюдаются нитевидные, ветвящиеся формы, не­редко зернистые формы (зерна Муха), как в виде свободно лежащих зерен, так и в виде зерен, содержащихся внутриклеточно. В организме больных под влиянием химиопрепаратов часто образуются ультрамалые формы, способные проходить через мелкопористые бактериальные фильтры («фильтрующиеся формы»).

Многие биологические свойства микобактерий объясняются высоким содержа­нием липидов, составляющих до 40 % сухого остатка клеток. Обнаружены три фрак­ции липидов: фосфатидная (растворимая в эфире), жировая (растворимая в эфире и ацетоне) и восковая (растворимая в эфире и хлороформе). В составе липидов имеются различные кислотоустойчивые жирные кислоты, в том числе туберкуло-стеариновая, фтиоидная, миколовая и др. Высокое содержание липидов определяет следующие свойства туберкулезных палочек:

1. Устойчивость к кислотам, щелочам и спирту.

2. Трудная окрашиваемость красителями.

3. Относительно высокая устойчивость к высушиванию и действию солнечных лучей.

4. Устойчивость к действию обычных дезинфицирующих веществ.

5. Высокая гидрофобность, которая находит свое отражение в культуральных свойствах.

6. С высоким содержанием липидов связана и патогенность туберкулезных бак­терий.

Тинкториальные свойства.

Грамположительны. Для их окрашивания применяют интенсивные методы. Например, по способу Циля-Нильсена окрашивают кон­центрированным раствором карболового фуксина при подогревании. Восприняв окраску, туберкулезные бактерии, в отличие от других клеток, не обесцвечиваются ни спиртом, ни кислотой, ни щелочью, поэтому при докрашивании метиленовым синим в мазке все бактерии, клеточные элементы и слизь окрашиваются в синий цвет, а туберкулезные палочки сохраняют исходную красную окраску. Этот метод позволяет дифференцировать их от некоторых непатоген­ных микобактерий, например М.smegmatis, содержащихся на слизистой оболочке уретры, но обесцвечивающихся спиртом. Вместе с тем необходимо иметь в виду, что встречаются и кислотоподатливые («синие» при окрашивании по Цилю-Нильсену) формы туберкулезных бактерий (в том числе палочковидные, нитевид­ные и зернистые).

По способности к пигментообразованию микобактерии также делят на 3 группы:

1. Фотохромогенные – образуют пигмент лимонно-желтого цвета при росте на свету.

2. Скотохромогенные – образуют пигмент оранжево-желтого цвета при инкуби­ровании в темноте.

3. Нефотохромогенные – пигмента не образуют (независимо от наличия света), иногда культуры имеют светло-желтоватую окраску.

Культуральные свойства.

Для культивирования туберкулезных бактерий предложены различные пита­тельные среды: глицериновые, картофельные с желчью, яичные, полусинтетические и синтетические. Наилучшей считается яичная среда Левенштейна-Иенсена. Кроме того, предложена специальная полужидкая среда для выделения L-форм М.tubercu­losis. На глицериновом бульоне рост в виде пленки желтоватого цвета, которая постепенно утолщается, становится ломкой и приобретает бугристо-морщинистый вид, при этом бульон остается прозрачным. На глицериновом агаре через 7-10 дней образуется сухой чешуйчатый налет, постепенно переходящий в грубые бородав­чатые образования. На щелочном альбуминате (или на стекле, помещенном в цитратную лизированную кровь) рост туберкулезных бактерий, содержащих поверхностный гликолипид (корд-фактор) змеевидный – размножающиеся клетки располагаются, образуя структуру, напоминающую змею, жгут, веревку или женскую косу.

По скорости роста род Mycobacterium подразделяют на три группы:

1. Быстрорастущие — крупные видимые колонии появляются ранее 7-го дня инкубации (18 видов).

2. Медленнорастущие — крупные видимые колонии появляются после 7-ми и бо­лее дней инкубации (20 видов).

3. Микобактерии, которые требуют специальных условий для роста или не растут на искусственных питательных средах. К этой группе относятся два вида: М. leprae и М. lepraemurium.

Физиологические свойства.

М. tuberculosis – аэроб, оптимальная температура для роста 37 °С, оптимальная рН - в пределах 6,4-7,0.

Биохимические свойства.

Микобактерии туберкулеза способны синтези­ровать ниацин, каталазная активность относительно слабая и утрачивается при 68 °С.

Антигенные свойства.

В антигенном отношении этот вид од­нороден (сероваров не выявлено), имеет большое сходство с М. bovisи М. microti, но существенно отличается от других видов. Однако микробная клетка имеет сложный и мозаичный набор антигенов, способных вызывать в организме человека и живот­ных образование антиполисахаридных, антифосфатидных, антипротеиновых и иных антител, различающихся по своей специфичности. Живые и убитые бактерии способны индуцировать развитие гиперчувствительности замедленного типа. Этим свойством не обладают ни белки, ни одна из липидных фракций микобактерий.

Для внутривидовой дифференциации М. tuberculosis разработана система класси­фикации, основанная на фаготипировании штаммов с помощью набора из десяти микобактериофагов: 4 основных и 6 вспомогательных.

Факторы патогенности.

Патогенность туберкулезных бак­терий связана с высоким содержанием липидов. Содержащиеся в липидах фтиоидная, миколовая и другие жирные кислоты оказывают своеобразное токсическое действие на клетки тканей. Например, фосфа­тидная фракция, наиболее активная из всех липидов, обладает способностью вызы­вать внормальном организме специфическую тканевую реакцию с образованием эпителиоидных клеток, жировая фракция – туберкулоидной ткани. Эти свойства указанных липидных фракций связаны с наличием в их составе фтиоидной кислоты. Восковая фракция, содержащая миколовую кислоту, вызывает реакции с образова­нием многочисленных гигантских клеток. Таким образом, с липидами, состоящими из нейтральных жиров, восков, стеринов, фосфатидов, сульфатидов и содержащими такие жирные кислоты, как фтиоидная, миколовая, туберкуло-стеариновая, пальми­тиновая и другие, связаны патогенные свойства туберкулезной палочки и те биологиче­ские реакции, которыми ткани отвечают на их внедрение. Главным фактором патогенности является токсический гликолипид (корд-фактор), который располагается на поверхности и в толще клеточной стенки. По химической природе он представля­ет собой полимер, состоящий из одной молекулы дисахарида трегалозы и связанных с ней в эквивалентных соотношениях миколовой и миколиновой высокомолекуляр­ных жирных кислот – трегалоза-6,6'-димиколат (С₁₈₆Н₃₆₆О_ш). Корд-фактор не только оказывает токсическое действие на ткани, но и защищает туберкулезные па­лочки от фагоцитоза, блокируя окислительное фосфорилирование в митохондриях макрофагов. Будучи поглощенными фагоцитами, они размножаются в них и вызы­вают их гибель. Корд-фактор обладает двумя характерными свойствами, указываю­щими на его важную роль как основного фактора патогенности.

1. При внутрибрюшинном заражении белых мышей он вызывает их гибель. Подобным действи­ем не обладает ни одна другая фракция туберкулезной палочки.

2. Он подавляет миграцию лейкоцитов больного туберкулезом человека (in vivo и in vitro).

М. tuberculosis, лишенные корд-фактора, являются непатогенными или слабопа­тогенными для человека и морских свинок. С необычным химическим составом туберкулезных клеток связана также способность их вызывать характерную для туберкулеза реакцию гиперчувствительности замедленного типа, выявляемую с по­мощью туберкулиновой пробы.

Эпидемиология инфекции.

Источником заражения являются больной туберкулезом человек, реже животные. От больного человека возбудитель выделяется главным образом с мокротой, а также с мочой, испражнениями и гноем. Туберкулезная палочка проника­ет в организм чаще всего через дыхательные пути – воздушно-капельным и, особенно часто, воздушно-пылевым путем. Однако входными воротами могут быть любые сли­зистые оболочки и любой поврежденный участок кожи. Заражение М. bovis от крупно­го рогатого скота происходит в основном алиментарным путем через инфицированные молоко и молочные продукты. Туберкулез, вызванный М. bovis, наблюдается чаще все­го у детей, поскольку молоко для них служит основным продуктом питания. Однако за­ражение М. bovisот больных животных возможно и аэрогенным путем.

Рассеянный солнечный свет убивает их лишь через 8-10 суток. В мокроте при кипячении гибель наступает через 5-7 минут. В высохшей мокроте жизнеспособность сохраняется в течение многих недель. 5 % раствор фенола при добавлении в равном объеме к мокроте вызывает гибель туберкулезных палочек через 6 ч, однако 0,05 % раствор бензилхлорфенола убивает через 15 мин.

Патогенез инфекции.

Род Mycobacterium включает более 40 видов. Как оказалось, многие из них нередко выделяются в различных странах мира от людей, теплокровных и холоднокровных животных, страдающих заболеваниями легких, кожи, мягких тканей и лимфатичес­ких узлов. Эти заболевания получили название микобактериозов. Различают три типа микобактериозов, зависящих от вида микобактерий и иммунного статуса орга­низма.

1. Генерализованные инфекции с развитием видимых невооруженным глазом патологических изменений, внешне напоминающих туберкулезные, но гистологиче­ски несколько отличающиеся от них.

2. Локализованные инфекции, характеризующиеся наличием макро- и микро­скопических поражений, выявляемых в определенных участках тела.

3. Инфекции, протекающие без развития видимых поражений – возбудитель обнаруживается в лимфатических узлах внутриклеточно или внеклеточно.

В зависимости от двух основных способов заражения первичный туберкулезный очаг локализуется или в легких, или в мезентеральных лимфатических узлах. Однако некоторые специалисты считают, что вначале проис­ходит лимфогематогенное распространение возбудителя в обоих случаях зараже­ния, а потом он избирательно поражает легкие или другие органы и ткани. При по­падании через дыхательные пути (или другим способом) в альвеолы и бронхиаль­ные железы туберкулезные палочки вызывают образование первичного аффекта в виде бронхопневмонического фокуса, из которого они по лимфатическим сосудам проникают в регионарный лимфатический узел, вызывая специфическое воспале­ние. Все это вместе: бронхопневмонический фокус + лимфангоит + лимфаденит – и образует первичный туберкулезный комплекс (первичный очаг туберкулеза). Туберкулезная палочка, благодаря наличию в ее клетках различных жирных кислот и других антигенов, вызывает в тканях определенную биологическую реакцию, ко­торая приводит к формированию специфической гранулемы – бугорка. В центре его обычно располагаются гигантские клетки Пирогова-Лангганса со множеством ядер. В них обнаруживаются туберкулезные палочки. Центр бугорка окружен эпителиоидными клетками, которые составляют главную массу бугорка. По периферии его располагаются лимфоидные клетки. Судьба первичного очага может быть раз­личной. В тех случаях, когда общая резистентность ребенка в силу ряда причин сни­жена, очаг может увеличиваться и подвергаться творожистому (казеозному) распаду в результате действия токсических продуктов туберкулезной палочки и отсутствия в бугорках кровеносных сосудов. Такая казеозная пневмония может стать причиной тяжелой первичной легочной чахотки, а при попадании возбудителя в кровь – гене­рализованного туберкулеза, приводящего ребенка к смерти. В большинстве же слу­чаев при наличии достаточно высокой естественной резистентности организма пер­вичный очаг через некоторое время окружается соединительнотканной капсулой, сморщивается и пропитывается солями кальция (обызвествляется), что рассматри­вается как завершение защитной реакции организма на внедрение туберкулезной палочки и означает формирование уже приобретенного нестерильного (инфекцион­ного) иммунитета к туберкулезу, так как микобактерии могут сохранять жизнеспо­собность в первичном очаге многие годы.

В случае заражения алиментарным путем туберкулезные палочки попадают в ки­шечник, захватываются фагоцитами слизистой оболочки и заносятся по лимфатиче­ским путям в регионарные кишечные лимфатические узлы, вызывая их характерные поражения. По мнению некоторых специалистов, туберкулезные палочки в этом случае через ductus thoracicus и правые отделы сердца также могут проникнуть в лег­кие и стать причиной туберкулеза легких.

Туберкулезная палочка может поражать практически любой орган и любую ткань с развитием соответствующей клиники заболевания.

Для клиники туберкулеза легких характерно чередование периодов выздоровле­ния, наступающих после эффективной химиотерапии, и частых рецидивов, причиной которых являются сохранение в организме туберкулезных палочек, особенно в виде L-форм, и изменение иммунного статуса больного. L-формы микобактерий мало вирулентны, но, возвращаясь в исходную форму, они восстанавливают виру­лентность и способны вновь и вновь вызывать обострения процесса.

 

Иммунитет.

Приобретенный постинфекционный иммунитет при туберкулезе имеет ряд осо­бенностей. Хотя у больных и переболевших обнаруживаются антитела к различным антигенам туберкулезной палочки, не они играют решающую роль в формировании приобретенного иммунитета. Инфицированный туберкулез­ной палочкой организм отвечает на повторное заражение совершенно иначе, чем здо­ровый, так как у него к возбудителю сформировалась повышенная чувствительность (сенсибилизация), благодаря чему он приобрел способность быстро связывать новую дозу возбудителя и удалять ее из организма. Сенсибилизация проявляется в виде ги­перчувствительности замедленного типа, она опосредуется системой Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты с помощью своих рецепторов и при участии белков МНС класса I рас­познают клетки, инфицированные туберкулезными палочками, атакуют их и разруша­ют. Специфические антимикробные антитела, связываясь с различными микробными антигенами, образуют циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) и способствуют удалению антигенов из организма. Вместе с тем, взаимодействуя с микробными клет­ками, антитела к корд-фактору и другим факторам вирулентности могут оказывать токсическое действие на микобактерии. Антитела к полисахаридным антигенам уси­ливают фагоцитоз, активируют систему комплемента и т. д.

Лабораторная диагностика.

Для диагностики туберкулеза применяют все ме­тоды: бактериоскопический, бактериологический, серологический, биологический, аллергические пробы, ПЦР. При бактериоскопическом исследовании исходного материала (мокрота, моча, гной, спинномозговая жидкость, испражнения) необхо­димо учитывать, что содержание в нем микобактерий может быть незначительным, выделение их эпизодическим и в нем могут быть измененные варианты возбудителя, в том числе L-формы. Поэтому для повышения вероятности обнаружения микобак­терий туберкулеза используют методы концентрирования их с помощью центрифу­гирования или флотации, атакже фазово-контрастной (для обнаружения L-форм) и люминесцентной микроскопии (в качестве флуорохромов используют аурамин, аурамин-родамин, акридиновый оранжевый и др.).

Биологический метод – заражение морских свинок – является одним из на­иболее чувствительных. Считается, что заражающая доза возбудителя для них со­ставляет несколько клеток. Морские свинки могут быть использованы и для обна­ружения L-форм туберкулезных бактерий, но в этом случае необходимо сделать несколько последовательных заражений, так как L-формы обладают меньшей ви­рулентностью и вызывают у свинок доброкачественную форму туберкулеза, которая в случае реверсии L-форм в исходное состояние может перейти в генерализо­ванный процесс.

Из числа серологических реакций для диагностики туберкулеза предложены РСК, РПГА, реакции преципитации, методы иммуноферментного анализа (в том числе точечного), радиоиммунный метод, иммуноблотинг, реакция агрегат-гемагглютинации (для обнаружения ЦИК) и др. Использование различных антигенов позволяет обнаруживать наличие определенных антител. Для совершенствования серологических методов диагностики туберкулеза важное значение имеет получение моноклональных антител к различным антигенам микобактерий. Это позволит вы­явить те специфические эпитопы туберкулезных бактерий и соответственно те анти­тела к ним, обнаружение которых имеет наибольшее диагностическое значение, а также позволит создать коммерческие тест-системы для иммунодиагностики ту­беркулеза.

Среди всех методов микробиологической диагностики туберкулеза решающим все же остается бактериологический. Он необходим не только для постановки диа­гноза болезни, но и для контроля эффективности химиотерапии, своевременной оценки чувствительности микобактерий к антибиотикам и химиопрепаратам, диа­гноза рецидивов туберкулеза, степени очищения больного организма от возбудителя и выявления его измененных вариантов, особенно L-форм. Исследуемый материал перед посевом необходимо обрабатывать слабым раствором серной кислоты (6-12 %) для устранения сопутствующей микрофлоры. Выделение чистых культур ми­кобактерий ведут с учетом скорости их роста, пигментообразования и синтеза ниацина. Вопрос о вирулентности микобактерий решается с помощью биологических проб и на основании обнаруже­ния корд-фактора. Для этой цели предложены цитохимические реакции. Они осно­ваны на том, что вирулентные микобактерии (содержащие корд-фактор) прочно связывают красители – нейтральный красный или нильский голубой – и при до­бавлении щелочи сохраняют цвет краски, а раствор и невирулентные микобактерии изменяют свою окраску.

Для более быстрого выделения возбудителя туберкулеза предложен метод мик­рокультур. Суть его состоит в том, что на предметное стекло наносят исследуемый материал, обрабатывают его серной кислотой, отмывают, стекло помещают в цитратную лизированную кровь и инкубируют при температуре 37 ⁰С. Уже через 3-4 суток рост микобактерий на стекле проявляется в виде микроколоний, которые к 7-10-му дню достигают максимального развития, а микобактерии хорошо выявля­ются при микроскопии. При этом вирулентные микобактерии образуют змеевидные колонии, а невирулентные растут в виде аморфных скоплений.

Лечение и профилактика.

Консервативное лечение туберкулеза проводят с помощью антибиоти­ков и химиопрепаратов.

Для профилактики помимо проведения широких социально-экономических меро­приятий, направленных на улучшение жизни населения, раннего и своевременного выявления больных туберкулезом и оказания им эффективной лечебной помощи, большое значение имеет плановая массовая вакцинация против туберкулеза. Она осуществляется вакциной БЦЖ. Ревакцинацию проводят в возрасте 7-12, 17-22 и 27-30 лет только лицам, отрицательно реагирующим на внутри- кожную пробу Манту.

Вакцина БЦЖ для внутрикожного применения. Состав: высушенные живые ослабленные туберкулёзные микобактерии вакцинного штамма. Назначение: для профилактики туберкулёза. Способ применения: внутрикожно в область наружной поверхности верхней трети левого плеча.

Очищенный туберкулин в стандартном разведении. Состав: раствор очищенного туберкулина в стандартном разведении с фенолом в качестве консерванта и твином-80 в качестве детергента. Назначение: для диагностики туберкулёза. Способ применения: внутрикожно (для пробы Манту).

Сухой очищенный туберкулин. Состав: сухой очищенный белковый дериват туберкулина. Назначение: для диагностики туберкулёза. Способ применения: внутрикожно в область средней трети внутренней поверхности предплечья. Реакция положительна при наличии инфильтрата не менее 5 мм в диаметре.

Альттуберкулин Коха. Состав: выпаренная при 70⁰ до 1/10 первоначального объёма 6-6-недельная культура туберкулёзной палочки на глицериновом бульоне, стерилизованная текучим паром и профильтрованная через бактерийные фильтры. Назначение: для диагностики туберкулёза в детском возрасте. Способ применения: только накожно – проба Пирке и накожная градуированная проба.