В последнее десятилетие неуклонно расширяется список изученных микробных процессов, реализуемых только при наличии достаточной плотности популяции (кворума). Эти исследования продолжают начатые уже около 100 лет тому назад изыскания. Уже тогда исследовался, например, вопрос о том, почему культивирование бактерий часто не удается, если взята слишком низкая плотность инокулята. В 1988 г. Дж. Шапиро [34] также писал, что споры миксобактерий прорастают только при достаточно высокой их концентрации в среде. Уже в начале 80-х годов, как известно, изучением плотность-зависимых процессов в микробных популяциях активно занимались В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан и др. (см., например [67, 68]). Была исследована природа некоторых химических факторов (ауторегуляторов), накапливающихся в культуре и вызывающих те или иные эффекты, например, автолиз клеток (фактор d2 жирнокислотной природы [68]). Оригинальные отечественные и зарубежные работы 80-х годов обобщены в монографии А.С. Хохлова "Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы" [69].
Работы 90-х годов резко усилили интерес к "эффектам кворума" в популяциях микроорганизмов. К числу описанных к настоящему времени процессов, протекающих лишь при достаточно высокой плотности популяции, принадлежат следующие явления [1, 8-15, 70]:
· Биолюминисценция у морских бактерий (Vibrio fischeri, V. harveyi).
· Агрегация клеток миксобактерий и последующее формирование плодовых тел со спорами
· Конъюгация с переносом плазмид у Enterococcus faecalis и родственных видов, а также у клубеньковых бактерий рода Agrobacterium
· Формирование клеток-швермеров у бактерий родов Proteus и Serratia
· Синтез экзоферментов и других факторов вирулентности у растительных (Erwinia carotovora, E. hyacinthii и др.) и животных (Pseudomonas aeruginosa) патогенов.
· Образование антибиотиков у представителей рода Streptomyces и у Erwinia carotovora
· Споруляция у бацилл и актиномицетов
· Стимуляция роста стрептококков и ряда других микроорганизмов
Раскрыты механизмы многих из указанных процессов; определены факторы межклеточной коммуникации, отвечающие за плотностно-зависимые процессы. Здесь необходимо сказать несколько слов о биокоммуникации в целом (предмет особой биологической науки под названием биосемиотика). Среди изучаемых данной наукой каналов коммуникации между живыми организмами, три канала коммуникации являются наиболее эволюционно-консервативными и в полной мере функционируют уже у одноклеточных форм жизни [4, 5]. Речь идёт о передаче информации путём 1) непосредственного (физического) контакта между организмами; 2) выработки диффундирующих в среде химических агентов; 3) генерации тех или иных физических полей. Все три канала коммуникации, вероятно, принимают участие в "эффектах кворума".
Физический контакт между организмами. Некоторые из плотностно-зависимых процессов включают в себя стадии, контролируемые недиффундирующими химическими факторами. Они прикреплены к генерировавшей их клетке, и их восприятие рецепторами другой клетки требует непосредственного межклеточного контакта. Так, в голодающей популяции миксобактерий Myxococcus xanthus наблюдается агрегация клеток с последующим формированием плодовых тел со спорами (эукариотическим аналогом этой системы служит кратко рассмотренный выше Dictyostellium discoideum). Процесс находится под контролем как диффундирующих, так и недиффундирующих химических факторов. Поздние его стадии, когда клеточная агрегация уже идёт в течение 6 часов и необходимо обеспечить достаточно компактную укладку клеток для формирования спор, контролируются недиффундирующим, прикреплённым к поверхности клетки белковым фактором С (продукт гена csgA) [10, 71, 72]. Мутанты по гену csgA не способны к согласованным клеточным движениям, необходимым для компактного расположения палочковидных клеток M. хanthus; эти мутанты не формируют и плодовых тел. Идентифицировано по крайней мере 16 генов, чья экспрессия зависит от фактора С [72].
Физический контакт клеток необходим также при коммуникации посредством поверхностных органелл, таких как например пили, и компонентов экзоплимерного матрикса, покрывающего отдельные клетки, их группы, всю колонию в целом. В частности, процесс агрегации и споруляции у M. xanthus зависит от пилей типа IV (гомологи пилей типа IV есть у патогенных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Neisseria gonorhoeae, где они также обусловливают социально координированные клеточные движения [73]), от полисахаридно-белковых фибрил и от липополисахаридного О-антигена внешнего слоя наружной мембраны [1, 73, 74]. Все эти поверхностные клеточные структуры синтезируются с помощью так называемых S (social) генов, ответственных за коллективные, координированные перемещения клеток и формирование структур надклеточного уровня. Им противопоставляют также имеющиеся у миксобактерий А (adventurous) гены, позволяющие индивидуальным клеткам покидать край растущей колонии.
Своего рода промежуточное положение между недиффундирующими и свободно диффундирующими агентами коммуникации у миксобактерий занимают тяжи (trails) из биополимеров матрикса, которые отделяются от образовавшей их клетки, тем самым пролагая путь другим клеткам-"путешественницам", дающим начало дочерним колониям [75]. Интересно, что аналогичную роль в сообществе муравьев играют так называемые следовые торибоны, маркирующие след мураьвьёв-фуражиров ("первопроходцев") [76]. Естественно, что роль контактной (и "следовой") коммуникации в её различных вариантах не ограничивается только миксобактериальными системами. Например, пили участвуют в агрегации клеток в колониях Neisseria gonorrhoeae [1]. У эукариотических микроорганизмов, в частности, у Dictyostellium discoideum, контактные взаимодействия участвуют в морфогенезе наряду с диффундирующими химическими агентами. Несоменную роль в этих взаимодействиях играют гликопротеины, характеризующие дальнейшую судьбу клеточных субпопуляций: клетки, дающие в дальнейшем споры, несут гликопротеин PsA, в то время как совершающая апоптоз субпопуляция (будущая ножка плодового тела) имеeт антиген MUD9 [77].
Дистантная химическая коммуникация на службе "эффектов кворума". Тема химической коммуникации у микроорганизмов настолько широка (она была рассмотрена в более ранних авторских работах [4, 5, 78]), что мы ограничимся только теми диффузными химическими агентами, чьё участие в "эффектах кворума" установлено. Речь будет идти о следующих классах соединений: 1) ацилированные лактоны гомосерина, регулирующие широкий круг плотностно-зависимых коллективных процессов у грамотрицательных бактерий; 2) пептиды, регулирующие конъюгативный плазмидный перенос у Enterococcus, развитие воздушного мицелия у Streptomyces, споруляцию у бацилл и др.; 3) аминокислоты и сходные с ними аминные соединения, регулирующие агрегацию бактериальных клеток (E. coli, Salmonella typhimurium, Myxococcus xanthus) и формирование швермеров у Proteus mirabilis.
1. Кворум-зависимые системы с лактонами гомосерина как агентами межклеточной коммуникации (системы типа "luxI-luxR"). Рассмотрим вначале сравнительно хорошо изученные бактериальные системы, использующие ацилированные лактоны гомосерина. Классическим объектом служит морская светящаяся бактерия Vibrio fischeri [8, 12, 70]. Свечение является плотностно-зависимым процессом, т. е. не наблюдается в разбавленных клеточных суспензиях, например, просто в толще морской воды (плотность культуры менее 102 клеток/мл [70]). Свечение V. fischeri реализуется лишь в концентрированных культурах V. fischeri, в том числе в природных экологических нишах этой бактерии- в светящихся органах головоногого моллюска Euprymna scolopes, где плотность популяции достигает 1010-1011 клеток/мл [70]. Данная система, по-видимому, представляет пример взаимовыгодного межвидового сотрудничества "Моллюск, ночное животное, извлекает выгоду из того, что светящиеся бактерии делают его незаметным для хищников снизу; свечение, напоминающее лунный свет, устраняет тень, которая иначе возникала бы, если бы лунные лучи освещали моллюска сверху. А бактерия извлекает выгоду из того, что моллюск предоставляет питание и укрытие" [10, P.69]. Биохимию и генетику свечения V. fischeri исследовали поэтапно. Вначале удалось показать, что свечение культур V. fischeri, находящихся на ранней экспоненциальной стадии развития, может быть индуцировано культуральной жидкостью, отделённой от клеток V. fischeri во время стационарной фазы. Впоследствие была детально охарактеризована генетическая система " luxI – luxR " [12, 69, 70], оказавшаяся типичной для большинства известных плотностно-зависимых систем грамотрицательных бактерий.
Система включает 2 основных блока генов. Один из этих блоков—оперон luxICDABEG, чьи гены имеют следующие функции:
· Ген luxI кодирует белок (LuxI, 193 аминокислоты), который по всей вероятности функционирует как синтаза химического агента межклеточной коммуникации, чьё накопление в среде сигнализирует клеткам V. fischeri о достижении пороговой плотности (кворума) для биолюминесценции. Агент коммуникации синтезируется из S-аденозилметионина и 3-оксогексаноил-кофермента А и представляет собой N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина (3-ОГЛГ).
· Гены luxA и luxB кодируют, соответственно, субъединицы a и b люциферазы (ферментного комплекса, ответственного за биолюминсценцию).
· Гены lux C,D, E кодируют редуктазу жирных кислот (один из окисляемых субстратов в ходе люциферазной реакции, приводящей к испусканию кванта света)
· Ген lux G кодирует редуктазу флавинмононуклетида (другой субстрат, также окисляемый в люциферазной реакции).
Другой генный блок включает ген lux R, чей белковый продукт LuxR (250 аминокислот) связывает фактор 3-ОГЛГ. Комплекс LuxR-3-ОГЛГ связывается с промоторным участком оперона luxICDABEG и активирует его транскрипцию. В отсутствие 3-ОГЛГ оперон luxICDABEG экспрессируется на низком "базовом" уровне. Белок LuxR в отсутствие 3-ОГЛГ функционирует как репрессор, в частности, гена luxR, кодирующего сам этот белок. По мере повышения концентрации клеток V. fischeri накапливающийся в среде 3-ОГЛГ начинает выступать как "аутоиндуктор": наряду со структурными генами его комплекс с LuxR активирует и транскрипцию luxI, т.е. синтез самого 3-ОГЛГ [10, 12, 70], активирующего в комплексе с LuxR траскрипцию оперона lux в новых и новыхклетках V. fischeri. Поэтому лавинообразно нарастает синтез всех компонентов люциферазной системы и начинается интенсивное свечение бактерий.
По принципу описанной системы luxI-luxR организованы (с теми или иными модификациями) кворум-зависимые регуляторные системы и у ряда других грамотрицательных бактерий (таблица). В роли диффундируюших химических факторов коммуникации также выступают ацилированные лактоны гомосерина. Одна и та же бактерия может включать несколько плотностно-зависмых систем. Так, в последние годы показано, что рассмотренная выше светящаяся бактерия V. fischeri фактически имеет и вторую плотностно-зависимую систему регуляции биолюминисценции ainI-ainR со своим активатором транскрипции (AinR), связывающим диффузный фактор N-октаноил-L-лактон гомосерина [8].
Аналогично, две кворум-зависимых системы с N-(3-оксибутаноил)-L-лактоном гомосерина и пока не идентифицированным соединением (условно названным AI-2) как диффузными агентами межклеточной коммуникации регулируют свечение у родственной морской бактерии Vibrio harveyi. Однако, наряду с активатором транскрипции (LuxR), у V. harveyi есть также и репрессор (LuxO). Его инактивация достигается сочетанным действием диффузных продуктов обоих систем: N-(3-оксибутаноил)-L-лактон гомосерина связывается белком LuxN, a AI-2 – белками LuxP и LuxQ, которые представляют собой гистидиновые киназы. Они инициируют работу каскада киназ, который и приводит к модификации путём фосфорилирования репрессора LuxO и, таким образом, к активной работе системы биолюминесценции [79].
Бактерии рода Erwinia (E. carotovora, E. chrysanthemii и др.) вызывают мягкую гниль картофеля, хризантем и других растений. Они расщепляют растительные клеточные стенки с помощью пектиназ и целлюлаз. Образование этих ферментов является важным фактором вирулентности Erwinia и представляет собой плотностно-зависимый процесс.[12, 70, 80]. Поэтому при достаточно высокой плотности популяции бактерий синтез ферментов происходит столь интенсивно, что клетки растений разрушаются раньше, чем их иммунная система успевает прореагировать на внедрение патогена. У Erwinia функционирует генная система expI-expR, аналог системы luxI-luxR у V. fischeri. Белок ExpI, частично гомологичный белку LuxI, необходим для синтеза диффузного фактора коммуникации – 3-ОГЛГ (как и у V. fischeri). В силу совпадения факторов коммуникации у Erwinia и у V. fischeri, введение плазмиды, содержащей все гены lux V. fischeri, за вычетом luxI, обусловливает плотностно-зависимую люминесценцию у E. carotovora [80].
У E. carotovora, кроме expI-expR, имеется также аналогичная генная система carI-carR. Система carI-carR ставит синтез антибиотика карбапенема, образуемого E. carotovora, в зависимость от плотности популяции. Активация синтеза антибиотика при высокой плотности популяции посредством системы carI-carR предположительно облегчает E. carotovora устранение бактерий-конкурентов, которые стремятся использовать продукты расщепления компонентов растительных клеток кворум-зависимыми экзоферментами E. carotovora [12, 70].
Помимо 3-ОГЛГ как фактора коммуникации в кворум-зависимых системах, у бактерии E. chrysanthemii обнаружены и другие феромоны [80] (см. таблицу). На примере этой бактерии продемонстрировано, что плотностно-зависимые геннные системы в то же время находятся под контролем других регуляторных систем, в том числе зависимых от цАМФ (и связывающего цАМФ белка CRP [80]; такая зависимость показана и для V. fischeri). Кворум-зависимые системы, таким образом, оценивают не только плотность популяции, но и другие параметры внешней среды через посредничество соответствующих генных регуляторов.
Патогенная для человека и животных бактерия Pseudomonas aeruginosa ("синегнойная палочка"), подобно E. carotovora, синтезирует необходимые для вирулентности факторы – токсин А, экзоферменты (эластазы LasA и LasB, щелочную протеазу), гемолизины и поверхностно-активный рамнолипид.—при наличии бактериального кворума [70, 82]; имеются две генные системы: lasI-lasR и vsmI-vsmR.
Примеры с V. fisheri, E. carotovora и P. aeruginosa демонстрируют, что микробные клетке вступают во взаимодействие с макроорганизмом (растением или животным) только в том случае, если концентрация феромона сигнализирует о достаточной плотности микробной популяции. Это взаимодействие может быть паразитического или/и взаимовыгодного (мутуалистического) типа. Дополнительные примеры представляют
· Клубеньковые бактериир. Rhizobium. Так, штаммы R. leguminosarum bv. viciae отвечают за формирование азотфиксирующих клубеньков в корневых системах бобовых растений. Соответствующая кворум-зависимая генная система rhiI-rhiR обусловливает интенсивную экспрессию генов rhiABC при высокой плотности популяции. Белковые продукты данных генов участвуют во взаимодействии между бактериальным симбионтом и клетками ризосферы, хотя их функции до конца не выяснены. Интересно, что у родственного вида R. etli функционирует дополнительная генная система raiI-raiR, участвующая в ограничении количества клубеньков на корнях растения-хозяина (мутанты по этой системе формируют вдвое больше клубеньков на корнях фасоли, чем дикий тип) [83].
· Бактерия Agrobacterium tumefaciens, формирующая корончатые галлы у многих видов бактерий. Галы представляют растительный аналог злокачественной опухоли и образуются в результате переноса онкогенных фрагментов ДНК от бактерии в ядро растительной клетки посредством Ti-плазмид. Некоторые из генов Ti-плазмид обусловливают синтез опинов, которые служат питательным субстратом для A. tumefaciens. Гомологичная luxI-luxR генная система traI-traR стимулирует распространение Ti-плазмид в бактериальной популяции. Поскольку сама система traI-traR локализована на плазмиде, она, как и плазмиды "addiction modules" (см. выше подстраничную сноску 1), соответствует теории "эгоистичной ДНК" социобиолога Р. Докинза. Плазмидная ДНК стремится распространиться в популяции бактерий и, как только имеется достаточный "кворум", побуждает несущие плазмиду клетки конъюгировать с другими бактериальными клетками! [13]. В то же время конъюгативный перенос Ti-плазмид зависит от опинов и, таким образом, возможен лишь в ситуации успешного взаимодействия микробиоты и макроорганизма (растения, формирующего опин-продуцирующую опухоль). В частности, транскрипция traR стимулируется фактором OccR, активируемым октопином (одним из опинов) [70].
Формирование клеток-швермеров, способствующее распространению бактериальной популяции по плотной среде и колонизации различных экологических ниш (в том числе и тела макроорганизма) регулируется у некоторых бактериальных видов системами типа luxI-luxR. Так, генная система swr стимулирует движение клеток-швермеров по плотной среде у Serratia liquefaciens. Предполагается, что продуктом плотностно-зависимых генов swr является внеклеточное поверхностно-активное вещество (аналог рамнолипида у Pseudomonas aeruginosa), облегчающее швермерам передвижение по поверхности питательной среды [84].
Данные о плотностно-зависимых системах типа luxI-luxR и соответствующих феромонах обобщены в таблице. Как уже было отмечено, многие из таких систем важны для регуляции поведения симбиотической (паразитической) микрофлоры, с целью налаживания взаимодействия с макроорганизмом. Более того, коммуникация посредством ацилированных лактонов гомосерина может иметь межвидовой характер. В частности, вырабатываемый Pseudomonas aeruginosa феромон N-(3-оксо)-додеканоил-лактон гомосерина воспринимается эпителиальными клетками человека и индуцирует синтез интерлейкина-8, одного из факторов межклеточной коммуникации, участвующего в имунной защите у человека [8].
Некоторые системы с лактонами гомосерина в роли феромонов способствуют устранению микроорганизмов-конкурентов, синтезируя антибиотики, бактериоцины. Так, генная система phzI-phzR регулирует синтез противогрибковых антибиотиков у Pseudomonas aureofaciens [12]. Актиномицеты рода Streptomyces располагают плотностно-зависимыми системами, регулирующими синтез антибиотиков, развитие воздушного мицелия и спорообразование. Феромонами в этой системе служат (γ-бутиролактоны гомосерина [12]. Однако генетическая система отличается от luxI-luxR типа. γ-Бутиролактоны гомосерина (А-фактор у S. griseus) связываются не с активатором транскрипции, а с репрессором, теряющим активность в результате этого взаимодействия [70]. В роли бактериоцина (ингибитора роста бактерий) выступает один из образуемых бактериями р. Rhizobium лактонов гомосерина, а именно N-(3R-окси-7-цис-тетрадеканоил)-L-лактон гомосерина [83].
Соединения, напоминающие сигнальные агенты плотностно-зависимых систем прокариот, могут вырабатываться эукариотическими клетками как конкурентами или антагонистами прокариотов. "Зная" об информационных функциях подобных химических веществ у прокариот, эукариоты, вероятно, создают своего рода "дезинформационные помехи", "сбивая с толку" бактериальные клетки. Возможно, именно поэтому, например, галогенированные фураноны – близкие аналоги ацилированных лактонов гомосерина – образуемые красной водорослью р. Delysea, представляют собой эффективные антимикробные агенты [85].
Необходимо отметить, что феромоны микроорганизмов и, в частности, ацилированные лактоны гомосерина, могут использоваться в межвидовых взаимодействиях не только в роли антибиотиков/бактериоцинов, но также и в специяической роли сигнальных агентов. Это возможно потому, что различные виды микроорганизмов нередко имеют идентичные или очень сходные по химической природе феромоны [8]. В этой связи интересно, что, например, выделяемые P. аeruginosa внеклеточные вещества усиливают вирулентность факультативной патогенной бактерии Burkholderia cepacium [8].
2. Кворум-зависимые системы с пептидными и белковыми феромонами. "Классической" пептидной кворум-зависимой системой можно считать систему, отвечающую за конъюгативный перенос плазмид у Enterococcus faecalis и родственных бактериальных видов [70, 86]. Подобно рассмотренным системам типа luxI-luxR, эта система стимулирует распространение в микробной популяции признаков, важных для взаимодействия микроорганизма и животного-хозяина, а также для устранения микробных конкурентов. Так, переносимая пептидной кворум-зависмой системой плазмида pAD1 отвечает за синтез гемолизинов, плазмида pCD1 – за образование бактериоцина, а плазмида pCF10 – за устойчивость E. faecalis к тетрациклину [86].
Каждый феромон (гекса- или октопептид) индуцирует слипание (clumping) бактериальных клеток и их конъюгацию с переносом от донора к реципиенту определённой плазмиды. Например, октапептид cPD1 стимулирует конъюгативный перенос плазмиды pPD1. Плазмида кодирует феромонный рецептор, находящийся на белке-репрессоре соответствующего оперона. Так, плазмидa pPD1 несёт ген traA с указанной функцией [86]. Феромон взаимодействует с рецептором и выводит из строя репрессор, запуская синтез соответствующего продукта. Плазмида pPD1 включает также ген traC, чей продукт представляет собой феромон-связывающий белок, облегчающий проникновение пептида-феромона через клеточную стенку (эффективность феромона в сферопластах не зависит от экспрессии гена traC [82]). Феромоны интенсивно синтезируют только клетки, не несущие соответствующих плазмид. У клеток-доноров подавлен синтез феромона; более того, плазмида кодирует ингибирующий пептид. Продуктом плазмиды pPD1, например, является пептид iPD1, инактивирующий феромон cPD1 [69, 86].
У Bacillus subtilis споруляция эффективно происходит при высокой плотности клеточной популяции или при добавлении культуральной жидкости от подобной популяции. Процесс регулируется плотностно-зависимой системой с олигопептидным сигнальным агентом, кодируемым геном pfrA в форме неактивного предшественника (пептида, состоящего из 41 аминокислоты). При экскреции из клетки у этого пептида, как у многих других сигнальных пептидов, отщепляется N-концевая последовательность. Остающийся пептид (19 аминокислот) в свою очередь подвергается воздействию внеклеточной пептидазы, в результате чего получается активный сигнальный пентапептид (РЕР5) [87].
Выяснен механизм активации споруляции у B. subtilis посредством РЕР5. Он поглощается внутрь клетки с помощью пермеазы олигопептидов и при достаточной концентрации ингибирует фосфатазу RapA, образуя с ней неактивный комплекс. В отсутствии активной фосфатазы ключевые факторы споруляции Spo0F и Spo0A поддерживаются в рабочем – фосфорилированном – состоянии. Интересно, что ген фосфатазы rapA ко-транскрибируется вместе с геном pfrA – они образуют единый оперон. При низкой клеточной плотности образуемый после экскреции и процессинга PfrA пептид РЕР5 поступает в клетку в низкой (подпороговой) концентрации, и тогда Spo0F и Spo0A дефосфорилируются посредством RapA – споруляции не происходит. Достижение кворума означает формирование комплекса PfrA:PEP5 и, соответственно, запуск программы споруляции [72, 86].
Высказаны сомнения, в том что пептид РЕР5 действительно служит феромоном в плотностно-зависимой системе, поскольку в культуральную жидкость попадают очень незначительные количества данного пептида. Не застревает ли он в клеточной стенке и не играет ли в этом случае цикл экскреции предшественника, его процессинга и обратного поглощения активного пептида просто роль своебразного таймера для процесса споруляции? [87]. По нашему мнению, низкая концентрация пептида в супернатанте культуры может означать его преимущественную локализацию во внеклеточном матриксе. Распространение химического агента по матриксу вполне совместимо с его феромонной ролью в масштабе бактериальной популяции.
Установлено, что плотностно-зависимые системы с пептидными феромонами регулируют компетентность к генетической трансформации у B. subtilis и Streptococcus pneumoniae (где активируется трансформация генов устойчивости к антибиотикам от других видов Streptococcus, вызывающих оральные инфекции), а также вирулентность Staphylococcus aureus [72, 88]. Интересно, что как и системы типа luxI-luxR, пептидные плотностно-зависимые системы регуляции во многих случаях функционируют у симбиотических/паразитических микроорганизмов.
Более того, макроорганизм также использует пептидные сигнальные агенты, выступающие в роли внутриорганизменных регуляторов. Например, в ответ на внедрение бактерий рода Rhizobium растение-хозяин (горох, соя и др.) образует пептид (около 10 аминокислот), который модифицирует эффект гормона ауксина на растительные клетки. А именно, изменяется концентрационная зависимость стимуляции ауксином клеточных делений. В норме (без этого пептида) максимальная ситмуляция наблюдается при ~5 мкМ ауксина, и эффект ослабляется при повышении концентрации ауксина. Однако в присутствии пептидного регулятора кривая концентрационной зависимости имеет плато вплоть до ~20 мкМ [89]. Белковый феромон в плотностно-зависимой системе у одноклеточной эукариоты – водоросли Volvox carteri – стимулирует рост этого микроорганизма уже в концентрации около 10-16М [14].
По-видимому, широко распространённым явлением у микроорганизмов является аутоиндукция роста, позволяющая преодолеть состояние глубокого покоя (dormancy) [9, 14, 16]. Так, культура Micrococcus luteus, голодавшая в течение 3-6 месяцев, претерпевает лишь немного клеточных делений после пересева на богатую среду; далее следует остановка роста. Однако, добавление 20-30% супернатанта другой культуры, доросшей до ранней стационарной фазы на богатой среде, предотвращает остановку роста голодавшей популяции M. luteus и обеспечивает ее нормальный рост [14, 22].
3. Кворум-зависимые системы с феромонами аминной (аминокислотной) природы. У миксобактерий Myxococcus xanthus, наряду с недиффундирующим фактором С (см. выше), имеется диффузный фактор А, ответственный за кворум-зависимуюинициациюагрегации клеток с последующим формированием плодовых тел [90] (агрегация не происходит при плотности клеток не менее 3.108 в мл). Фактор А является смесью аминокислот [72, 90] и представляет собой продукт действия внеклеточных протеаз на поверхностные белки клеток [90]. Комбинация фактора А и дефицита питательных веществ активирует двухкомпонентную систему генов sasS—sasR, инициирующую агрегацию клеток и формирование плодовых тел [72]. Интересно, что входящие в состав фактора А кетогенные аминокислоты в дальнейшем утилизируются клетками через глиоксилатный шунт [72].
Рассмотренные выше плотностно-зависимые системы типа luxI-luxR фактически относятся к системам, базирующимся на производных аминокислоты, а именно гомосерина. Гомосерин не входит в состав белков. но служит универсальным для всех живых организмов интермедиатом в синтезе некоторых аминокислот. Мы рассмотрели ацилированные лактоны гомосерина отдельно только потому, что эта система коммуникации является классической.
Макро- и микроструктура колоний E. coli формируется под влиянием образуемых ее клетками градиентов атрактанта - аспарагиновой кислоты [91]. Сложные орнаменты (концентрические круги, гексагональные решетки и др.) формируются при наложении двух градиентов феромона - 1)исходящего от центра колонии и 2) образуемого клетками на её периферии. Аспарагиновая кислота в то же время представляет собой эволюционно-консервативный сигнальный агент, втом числе один из нейротрансмиттеров (веществ, передающих возбуждение от нейрона к нейрону) у млекопитающих.
В этой связи интересно, что другие нейротрансмиттеры, а именно биогенные амины, также эволюционно-консервативные сигнальные молекулы, содержатся у микроорганизмов и, будучи добавленными к их культурам, оказывают ростовые и структурные эффекты на микробные колонии [18, 19, 92-95]. Так, серотонин (5-гидрокситриптамин), нейротрансмиттер и гистогормон у высших организмов, в то же время представляет интерес как возможный агент микробный коммуникации. Это предположение базируется на данных о стимуляции агрегации клеток E. coli, Rhodospirillum rubrum и миксобактерий рода Polyspondilum добавленным серотонином [18]. В тех же концентрациях (10-7—10-5 М) серотонин стимулирует рост микроорганизмов [18, 95].
Другой нейротрансмиттер и гормон—норадреналин, также ускоряет рост патогенных энтеробактерий. У патогенных штаммов он стимулирует синтез адгезина К99 и Шига-подобных токсинов I и II [92]. Примечательно, что норадреналин не стимулирует рост непатогенных штаммов E. coli (неопубликованные данные авторов этой статьи). Всё это подкрепляет предположение Лайта [92] об адаптивном характере ноадреналин-зависимой стимуляции роста бактерий. Патогенные энтеробактерии используют защитную реакцию организма (интенсивный синтез норадреналина в ответ на стресс,вызванный инфекцией) ради собственного блага. Микроорганизмы содержат многие другие нейротрансмиттеры и гормоны (гистогормоны) высших животных (γ-аминомасляная кислота, β-аланин, инсулин и др.) [92, 93], которые участвуют как во взаимодействиях между симбиотической/паразитической микробиотой и макроорганизмом, так, по-видимому, и в межклеточной коммуникации у микроорганизмов (подробнее см. наш обзор. [19]).
Исследование роли эволюционно-консервативных аминов и аминокислот в межклеточной коммуникации микроорганизмов и во взаимодействии микробиоты и животного организма – тема научной работы, проводимой коллективом автором в настоящее время. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электродетекцией нами обнаружен серотонин у Bacillus cereus и Staphylococcus aureus [96] (ранее он детектирован Страховской с соавт. у Enterococcus faecalis [95]), нораденалин у всех исследованных бацилл, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, дрожжей, грибка Penicillum chrysogenum, а дофамин – у широкого круга исследованных прокариот [96].
Представляет интерес также наличие у микроорганизмов белков, гомологичных рецепторам нейромедиаторов. Так, пурпурная фототрофная бактерия Rhodobacter sphaeroides содержит гомолог бензадипинового рецептора — одного из типов рецепторов к тормозному нейромедиатору γ-аминомасляной кислоте [97]. Известно, что митохондрии эукариотических клеток – симбиотические потомки прокариот, а именно, той их подгруппы, в состав которой входит и R. sphaeroides. Поэтому исследования бактериальных рецепторов к нейромедиаторам и в целом эффектов эволюционно-консервативных нейромедиаторов в микробных системах весьма актуальны для нейрохимии мозга в связи с данными о роли митохондрий мозговых нейронов в связывании нейромедиаторов. Mитохондрии нейронов содержат рецепторы к глутамату (NMDA-подтипа) [98]. Если глутамат присутствует в высоких концентрациях, его связывание с этими митохондриальными рецепторами ведёт к массивному поступлению ионов Са 2+ внутрь митохондрий, диссипации мембранного потенциала, снижению внутриклеточной концентрации АТФ и в конечном счёте к апоптозу (см. выше). Апоптоз нейронов мозга в связи с избыточными концентрациями глутамата и других нейромедиаторов, вероятно, происходит при таких нейродегенеративных заболеваниях, как ишемический инсульт, болезни Паркинсона, Альцгкймера и Хантингтона [98].
Необходимо указать на ещё один класс микробных сигнальных молекул, также представляющих собой эволюционно-консервативные агенты – на олигосахарины. К данному классу веществ относятся короткие цепочки из моносахаридных остатков, к которым могут быть прикреплены липидные фрагменты. Пример представляет факторы Nod, вырабатываемые клубеньковыми бактериями (р. Rhizobium, плотностно-зависимая система типа luxI-luxR рассмотрена выше) в контексте обмена сигналами между ними и клетками бобового растения-хозяина. Выделяемые растением флавоноиды активируют транскрипцию бактериальных генов nod. Непосредственно активируется ген nodD, чей продукт служит активатором других генов nod. Продукты этих генов (в частности NodС) отвечают за синтез факторов Nod – ацилированных коротких хитиновых фрагментов (2-5 хитиновых мономеров в цепи). Они вызывают множественные эффекты на корневые клетки, приводящие к их дедифференцировке, активному делению и формированию клубеньков, содержащих клетки бактерий, превратившиеся в азотфиксирующие бактероиды под воздействием сигналов растения [10, 99, 100].
В свете современных данных, олигосахарины и подобные им соединения образуются также высшими растениями и животными. Так, белок DG42, гомолог NodC Rhizobium, присутствует в эмбрионах лягушки Xenopus начиная со стадии средней бластулы и вплоть до стадии нейрулы. Белок DG42 также способен к синтезу хитиновых олигосахаридов [101].
E. coli, Bacillus subtilis, дрожжи Candida utilis выделяют в окружающую среду ряд однотипных соединений,способствующих адаптации микроорганизмов к разным стрессовым условиям - смене среды роста, повышенной температуре,присутствию антибиотиков или N-этилмалеимида [102-104]: 1) "m -замедлина" (фактора ХII), снижающего скорость роста бактерий и тем самым способствующего преодолению стресса по принципу "снижая передачу у автомобиля, повышаешь его проходимость"; 2) антилизина (фактора ХI), ускоряющего адаптацию клеток к N-этилмалеимиду (не обнаружен у C. utilis); 3) "фактора ускоренной адаптации к новой среде" (ФУАНС) [102-104]. Подобно лактонам гомосерина, данные сигнальные вещества активны и на межвидовом уровне – так, феромоны E. coli вызывают специфические эффекты у B. subtilis и C. utilis (например, "m -замедлин" E. coli оказывал рост-ингибирующее действие на растущие клетки B. subtilis) [104].
Мы рассмотрели ряд важнейших химических факторов коммуникации между микробными клетками, но их перечень, конечно, остаётся неполным. Более того, список микробных сигнальных агентов непрерывно пополняется в последние годы, особенно в связи с изучением эволюционно-консервативных агентов межклеточной/межорганизменной коммуникации.Помимо рассмотренных биогенных аминов, к ним относятся также, например, активные формы кислорода (АФК), такие как О2-, Н2О2, ОН. и их производные. АФК, вероятно, выступают как водители ритма колебательных процессов, регулирующих активность различных биосистем; их воздействие может передаваться в виде резонансного возбуждения по межклеточному матриксу; матрикс способен к генерации собственных АФК, хотя и с низкой эффективностью (В.Л. Воейков, неопубликованная рукопись). Как производное АФК рассматривают окись азота, нейромедиатор и эволюционно-консервативный регулятор разнообразных процессов у про- и эукариот (ср. наш обзор [19]).
Физические факторы межклеточной коммуникации у микроорганизмов. В литературе накапливаются данные о взаимовлиянии микробных колоний в ситуации, когда невозможен обмен химическими сигналами. Так, гибнущая под воздействием хлорамфеникола культура Vibrio costicola посылает сигнал, стимулирующий рост другой культуры, отделенной от неё слоем стекла [105]. В ряде случаев предполагается синергидное действие различных каналов межклеточной коммуникации, а именно химических сигналов и физических полей; это вытекает из опытов по влиянию одной бактериальной колонии на адгезивные свойства другой (Ю.А. Николаев, неопубликованные данные). Клетки Bacillus carbonifillus повышают свою резистентность к антибиотикам и их рост стимулируется в ответ на сигналы, посылаемые другой микробной культурой (того же или иного вида бактерий); опыт ставили так, что донор и реципиент сигналов культивировали на двух половинах одной чашки Петри, разделенных сплошной стеклянной перегородкой [106, 107]. В качестве конкретных физических факторов гипотетически предлагаются: 1) электромагнитные волны [105] (по аналогии с эукариотическими клетками, где эффекты ультрафиолетовых лучей установлены – это митогенетический эффект А. Гурвича); 2) ультразвук [106, 107].
Необходимо признать, что физические факторы дистантной коммуникации микробных клеток и их роль в п<