Глава 1. Активные формы кислорода и механизмы их генерации в клетках аэробных

КОФЕРМЕНТ G

биосинтез КАРОТИНОИДЫ

АКТИВНЫЕ ФОРМЫКИСЛОРОД/

КОФЕ

РАСТИТЕЛЬНЫЕ АНТИО1

ТЕОРИИ СТА

АРОТИН

ФЕНОЛЬНЫЕ АНТИОК

Л

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Е. И. Шарова

АНТИОКСИДАНТЫ

РАСТЕНИЙ

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

 

ИЗДАТЕЛЬСТВО САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

УДК 581.19(075)

ББК 28.57 Ш25

Рецензенты: проф. И. П. Гаврилюк (ВНИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова); проф. И. М. Кис- люк (Ботан. ин-т им. В. Л. Комарова РАН); проф. Н. Д. Ещенко и доц. О. В. Галкина (С.-Петерб. гос. ун-т)

Печатается по решению
Учебно-методической комиссии
биологического факультета
С.-Петербургского государственного университета

Шарова Е. И.

_Ш25 Антиоксиданты растений: учеб. пособие. — СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та. 2016. — 140 с.

ISBN 978-5-288-05641-3

В пособии рассмотрена роль антиоксидантов растений в защите от активных форм кис­лорода (АФК) — продуктов метаболизма всех аэробных организмов, включая растения, жи­вотных и человека. Подробно описаны механизмы возникновения различных АФК в клет­ках и те угрожающие жизни процессы, которые вызывают АФК. Особое внимание уделено механизмам пероксидации липидов и свободнорадикальным теориям старения. Проанали­зировано понятие «антиоксидант» и сделан обзор методов оценки антиоксидантной актив­ности. Центральную часть книги занимают главы, в которых рассмотрены основные группы растительных антиоксидантов: аскорбиновая кислота, терпеноидные хиноны, каротиноиды, пептиды, фенольные соединения. Представлена информация о биосинтезе, окислительно­восстановительных превращениях и рециклизации антиоксидантов, описаны их функции в растениях. Критически обсуждена роль растительных антиоксидантов в питании человека.

Учебное пособие предназначено для студентов и аспирантов, изучающих биохимию расте­ний, а также для широкого круга лиц, интересующихся вопросами функционального питания.

ББК 28.57

К изданию рукопись подготовлена при финансовой поддержке
исследовательского гранта РФФИ № 14-04-01624

© С.-Петербургский государственный университет, 2016

ПРЕДИСЛОВИЕ

Антиоксиданты — тема очень популярная как в научной литературе, так и в средствах массовой информации. Этим веществам ежегодно посвящаются сотни тысяч научных статей, десятки книг. СМИ ежечасно агитируют приобретать различные препараты с высокой анти­оксидантной активностью. Эта реклама изобилует грубейшими ошибками: неправильно про­износятся названия веществ, неверно расставляются ударения в словах. Подобная реклама не столько информирует, сколько дезинформирует людей о свойствах антиоксидантов. В данных обстоятельствах автор, в течение многих лет преподающий биохимию растений в Санкт- Петербургском университете, ощутила необходимость изложить профессиональный взгляд на растительные антиоксиданты. Конечно, только читатель, знакомый с основами биохимии, сможет в полной мере осмыслить содержание книги. Тем не менее автор стремилась таким образом излагать материал, чтобы даже неподготовленный читатель смог извлечь для себя по­лезную информацию об антиоксидантах растений.

Изучение антиоксидантов составляет раздел редокс-биологии — науки о редокс-превраще- ниях в живых организмах. У аэробных организмов большинство окислительно-восстановитель­ных химических реакций (редокс-реакций) происходит с участием молекулярного кислорода и катализируется ферментами. Однако существует немало спонтанных превращений, среди которых наибольшее внимание ученых привлекают реакции, вызываемые активными форма­ми кислорода (АФК) и приводящие к необратимым окислительным повреждениям важнейших биомолекул. Функция антиоксидантов состоит в том, чтобы предотвращать эти реакции.

Таким образом, антиоксидант — антагонист АФК. Диалектика подсказывает, что эти две противоположности не только борются друг с другом, но и составляют неразрывное единство. Новые научные факты подтверждают данную идею. Оказалось, что АФК необходимы для жиз­недеятельности. Они регулируют рост и развитие живых организмов, участвуют в защитных реакциях на неблагоприятные воздействия, в заживлении повреждений. Постепенно форми­руется представление о совокупности антиоксидантов и прооксидантов как части гомеоста­за — системы поддержания внутренней среды живых клеток.

Растительная биохимия существенно богаче биохимии животных. Неудивительно, ведь растения синтезируют все нужные им органические молекулы, тогда как животные во многом полагаются на готовые биомолекулы, поступающие с пищей. Это касается и антиоксидантов. Наш организм не способен сам синтезировать аскорбиновую кислоту, каротиноиды, флавоно­иды и другие фенольные вещества. Поэтому растительная пища служит для человека источни­ком не только питательных веществ, но и антиоксидантов.

В этой книге описание важнейших антиоксидантов растений включает характеристику их физико-химических свойств, биосинтеза, окислительно-восстановительных превращений, рециклизации, функций. Излагая данный материал, автор руководствовалась следующими об­щими идеями об антиоксидантах растений:

1) они не столько подавляют, сколько контролируют протекание спонтанных окислитель­ных реакций в живых клетках;

2) их функции не ограничены антиоксидантной активностью;

3) среди них есть универсально распространенные в живой природе, и такие антиокси­данты нужно рассматривать в сравнительном аспекте;

4) многие из них составляют непременный элемент питания человека, поэтому необходи­мо обсудить, что с ними происходит в нашем организме.

Традиционно при описании антиоксидантов их делят на две группы:

1) молекулы, непосредственно участвующие в гашении АФК (например, аскорбиновая кислота);

2) ферменты, убирающие АФК каталитическим путем (например, аскорбатпероксидаза).

Стремление показать значение антиоксидантов растений для человека заставило автора отказаться от хрестоматийной схемы. Ферменты антиоксидантной защиты рассмотрены в гла­вах, посвященных их субстратам: супероксиддисмутазы и каталазы при описании АФК, фер­менты глутатионового и аскорбат-глутатионового циклов при описании глутатиона и аскор­биновой кислоты.

В основу книги положены спецкурсы «Антиоксиданты растений» и «Активные формы кислорода у растений», которые автор читает студентам биологического факультета Санкт- Петербургского государственного университета.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБК — абсцизовая кислота

АДФ — аденозиндифосфорная кислота

АК — аскорбиновая кислота восстановленная

АМФ — аденозинмонофосфорная кислота

АТФ — аденозинтрифосфорная кислота

АФК — активные формы кислорода

ГДФ — гуанозиндифосфорная кислота

ГТФ — гуанозинтрифосфорная кислота

ДАК — дидегидроаскорбиновая кислота

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖК — жирная кислота

ИУК — индол-3-уксусная кислота (ауксин)

КоА — коэнзим А

МДАК — монодегидроаскорбиновая кислота

РНК — рибонуклеиновая кислота

СОД — супероксиддисмутаза

УДФ — уридиндифосфорная кислота

УФ — ультрафиолет

ФАД — флавинадениндинуклеотид

Фд — ферредоксин

ФМН — флавинмононуклеотид

GSH — глутатион восстановленный

GSSG — глутатион окисленный (глутатион-дисульфид)

NAD⁺ — никотинамидадениндинуклеотид окисленный

NADH — никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

NADP⁺ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

NADPH — никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный Pi — фосфат PPi — пирофосфат

ГЛАВА 1

АКТИВНЫЕ ФОРМЫКИСЛОРОДА
И МЕХАНИЗМЫИХ ГЕНЕРАЦИИ В КЛЕТКАХ

АЭРОБНЫХ ОРГАНИЗМОВ

Кислород — один из четырех органогенных элементов (С, Н, N, О), из которых построены все органические вещества, встречающиеся у живых существ. Молекуляр­ный кислород (О₂) необходим для эффективного извлечения химической энергии, запасенной в углеводах, липидах и белках. С его помощью ферменты класса оксидо­редуктаз осуществляют сотни тысяч жизненно важных окислительных реакций. Ак­тивные формы кислорода (АФК) — неизбежные участники аэробного метаболизма. Их «активность» проявляется в том, что они спонтанно, то есть без помощи фермен­тов, реагируют с органическими молекулами, что обычно приводит к повреждению последних. В ходе эволюции живые организмы научились не только бороться с АФК, но и использовать их. Этим объясняется существование многочисленных ферментов, генерирующих АФК. Таким образом, у живых организмов АФК возникают спонтан­но, как побочные продукты протекающих с участием молекулярного кислорода про­цессов, а также ферментативным путем.

1.1. Роль кислорода в эволюции жизни на Земле

Когда первые живые существа возникли на Земле, в ее атмосфере было мало О₂ (доли процента), но эти организмы в нем не нуждались — они были анаэроба­ми. Кислород появился в атмосфере Земли в значительных количествах примерно 2,5 миллиарда лет назад, главным образом в результате эволюции фотосинтеза у циа­нобактерий (синезеленых водорослей). Цианобактерии приобрели способность рас­щеплять воду, поглощая энергию Солнца, для извлечения атомов водорода и исполь­зования его восстановительного потенциала. Побочным продуктом при этом оказал­ся молекулярный кислород, который тоннами выбрасывался в атмосферу:

6СО₂ + 6Н₂О С₆Н₁₂О₆ + 6О₂.

2 2 6 12 6 2

Это, безусловно, был один из ранних в истории Земли процессов загрязнения

атмосферы продуктами жизнедеятельности. Первоначально большая часть генери-
руемого цианобактериями кислорода взаимодействовала с металлами и превращала

их в окислы металлов, которые дошли до наших дней в форме камней и руд. Только после завершения процесса окисления металлов кислород стал накапливаться в ат­мосфере. Накопление кислорода было полезным для живых организмов в двух от­ношениях. Оно привело:

1) к образованию озонового слоя в стратосфере, защищающего Землю от УФ-С-

радиации — электромагнитных волн длиной 100-280 нм. Это помогло организмам выйти из моря и колонизировать сушу; а также

2) к удалению растворенного в Мировом океане Fe²⁺ вследствие образования его нерастворимых комплексов с кислородом. В чем польза от удаления Fe²⁺ из раствора? Этот переходный металл, как и Cu⁺, быстро реагирует с Н₂О₂, производя токсичный гидроксил-радикал:

Fe²+ + НО Fe³+ + • ОН + ОН^-.

Реакцию открыл Генри Фентон в 1894 г.

Накопление кислорода в атмосфере привело к гибели большинства анаэробов. Выжили только те организмы, которые смогли перестроить свой метаболизм (стать аэробами) либо найти аноксическую среду. Эта среда и составляет местообитание современных анаэробов, для которых смертелен контакт с атмосферой, содержащей кислород.

Эволюционисты предполагают, что адаптация к накапливающемуся в атмосфере О₂ началась с появления белков, связывающих (хелатирующих) железо и таким об­разом защищающих клетки от «фентоновской химии» — многочисленных деструк­тивных процессов, порождаемых реакцией Фентона. В плазме крови человека эту функцию выполняют ферритин, одна олигомерная молекула которого связывает до 4500 ионов железа, и церулоплазмин, связывающий ионы меди. Организмы, которые приобрели толерантность к О₂, начали использовать кислород для метаболических превращений, катализируемых оксидазами, оксигеназами и гидроксилазами. В ре­зультате появилось много полезных веществ, например коллаген, необходимый всем животным для построения хрящей и костей.

Затем живые существа стали использовать О₂ для эффективной выработки энер­гии, создав электрон-транспортные цепи, в которых О₂ выступал терминальным ак­цептором электронов. Этот переход к аэробному метаболизму в 15 раз увеличил вы­ход АТФ, который можно получить при окислении биомолекул, например глюкозы.

Но почему предки цианобактерий сразу же не погибли от вырабатываемого ими молекулярного кислорода? Эволюционисты предполагают, что некоторые антиок­сиданты существовали даже тогда, когда в атмосфере Земли было не более 0,1% О₂. УФ-лучи бомбардировали Землю, лишенную озонового экрана, и превращали име­ющийся в воде О₂ в Н₂О₂. В те времена в воде было растворено много Fe²⁺, поэтому возникала угроза протекания реакции Фентона. У предков цианобактерий должны были появиться системы для разрушения Н₂О₂ — каталазоподобные ферменты, про­водящие следующую реакцию:

Н2О2 + Н2О2 + 2Н2О + О₂.

Эти ферменты, разлагающие Н₂О₂, позднее приобрели способность разлагать воду. Так в эволюции возник кислородвыделяющий комплекс фотосинтетического аппарата.

В истории Земли были периоды, когда концентрация атмосферного кислоро­да значительно превышала современную. В каменноугольном периоде она достига­ла 35%. В это время процветала растительность, уровень СО₂ упал и образовались огромные отложения угля и нефти, которые мы сейчас используем, повышая при этом уровень СО₂ в атмосфере. У растений и животных, живших в каменноугольном периоде, должна была сформироваться особенно сильная антиоксидантная защита. Поэтому для биологии активных форм кислорода значительный интерес представ­ляет изучение древних видов. Ведь даже сейчас они лучше переносят повышенные концентрации О₂, чем виды, возникшие в более поздние времена.

Все аэробы, включая бактерий, растения, животных и человека, страдают, когда подвергаются воздействию О₂ в высоких концентрациях. Окислительные поврежде­ния у них происходят и при нормальных концентрациях О₂. Причем сам молекуляр­ный кислород довольно инертен в химическом отношении. Его токсичность связана с тем, что он служит источником активных форм кислорода (АФК).

1.2. Молекулярная характеристика АФК

Многие химически активные формы О₂ представляют собой свободные радика­лы и ведут к появлению свободных радикалов и протеканию свободнорадикальных реакций. Свободный радикал — элемент, атом или группа атомов, способный к неза­висимому существованию и содержащий один или более неспаренных электронов.

Неспаренный электрон один занимает целую атомарную или молекулярную орби­таль. Простейший свободный радикал — атом водорода (Н ^-).

Радикалы могут возникнуть в результате гомолитического расщепления С-С, С-Н, С-О связей, но такие химические связи трудно разорвать. Есть связи, которые рвутся легко. Например, дисульфидная связь может разорваться даже при механиче­ском воздействии: -S-S- -+ -S ’ + ’ S-, а пероксидная — под действием ультрафиолета: Н-О-О-Н Н-О ’ + • о-н.

Свободные радикалы, и не только кислородные, в большинстве своем чрезвы­чайно химически активны. Важнейшие АФК, присутствующие в живых организмах, приведены ниже:

^• ОН — Гидроксил-радикал

О₂ ^{- -} — Супероксид-радикал

IKK — Гидропероксил-радикал (протонированный супероксид-радикал)

RO ^- — Алкоксил-радикал

LO ^- — Липидный алкоксил-радикал

ROO ^- — Алкил-пероксил-радикал

LOO ^- — Липидный пероксил-радикал

¹O₂ — Синглетный кислород

Н₂О₂ — Пероксид (перекись) водорода

ROOI — Гидропероксид (органическая перекись)

LOOI — Гидропероксид (гидроперекись) липида

Рассмотрим электронное строение так называемых первичных АФК — прямых неорганических производных молекулярного кислорода (рис. 1). В своем основном, триплетном, состоянии (³О₂) молекулярный кислород представляет собой свобод-

а*2р ф	о	о	о
тг*2Р ф ф	©о	©©	©©
* 2р ф (ф	©©	©©	©©
<7 2р ©	©	©	©
(7* 2s ©	©	©	©
о- 2s (ф	©	©	©
(7*ls (ф	©	©	©
<7 Is (ф	©	©	©
02	102	ОГ	о22-

Рис. 1. Электронное строение триплетного кисло­рода (О₂) и его активных форм

 

ный радикал, но, несмотря на это, он относительно инертен и не рассматривается

как АФК. Электроны, занимающие в атоме кислорода атомарные p-орбитали второго энергетического уровня (2p), при объединении двух атомов в молекулу ³О₂ занима­ют молекулярные п- и а-орбитали таким образом, что появляется два неспаренных электрона с одинаковыми спинами. Параллелизм спинов этих неспаренных электро­нов объясняет низкую химическую реактивность ³О₂. Он накладывает на нее так на­зываемое спиновое ограничение.

Молекулярный кислород в основном состоянии легко окисляет соединения с двумя неспаренными электронами, имеющими параллельные спины. Но такие сое­динения встречаются редко. Он также легко принимает один неспаренный электрон, то есть легко взаимодействует со свободными радикалами. Двухэлектронное и четы­рехэлектронное восстановление ³О₂ до O/^- (Н₂О₂) и 04^- (Н₂О), соответственно, проис­ходящее in vivo в разнообразных реакциях биологического окисления, опирается на серию катализируемых ферментами одноэлектронных восстановлений молекулярно­го кислорода. Ферменты, осуществляющие восстановление молекулярного кислоро­да, обычно имеют радикал в активном центре, например ион железа.

Синглетный кислород (¹О₂) был открыт в 1964 г. — почти на двести лет позд­нее триплетного, открытого Джозефом Пристли в 1772 г. Он не является свобод­ным радикалом, так как у него нет неспаренного электрона (рис. 1). У синглетного кислорода спиновое ограничение снимается в результате изменения спина одного из p-электронов. Поэтому он легко окисляет многие вещества и из-за своей высокой химической реактивности имеет очень короткие время жизни (несколько микросе­кунд) и длину пробега (0,02-0,15 мкм).

В живых организмах постоянно генерируется О/ _ — супероксид-радикал (рис. 1). У супероксид-радикала спиновое ограничение снимается благодаря присоедине­нию к молекулярному кислороду одного электрона. В кислой среде супероксид-ра­дикал протонируется и переходит в форму гидропероксил-радикала: О/ ^- + H+ HO/ (pKa 4,8).

Пероксид-радикал (O₂^2-, в протонированной форме — пероксид водорода Н₂О₂), образующийся при добавлении еще одного электрона к супероксид-радикалу, значи­тельно активнее молекулярного кислорода (рис. 1). У него ослаблена связь между ато­мами кислорода. Однако это наиболее стабильная и наименее реактивная АФК. Поэ­тому пероксид водорода может в значительных количествах накапливаться в клетках и перемещаться из одного компартмента клетки в другой, пересекая биологические мембраны.

1.3. Генерация АФК фотосенсибилизаторами

Фотосенсибилизатор — это органическая молекула, которая, поглощая фотон, переходит в возбужденное состояние, затем вызывает химическое превращение дру­гой молекулы и возвращается в исходное состояние. Основной первичной мишенью фотосенсибилизаторов в аэробных условиях является триплетный кислород, кото­рый превращается в высокореактивный синглетный.

У растений мощным фотосенсибилизатором выступает хлорофилл. Поэтому в процессе фотосинтеза в хлоропластах интенсивно образуется ¹О₂ (рис. 2). Его обра­зование — результат неадекватной диссипации (рассеивания) избытка энергии хло­рофилла, перешедшего в триплетное состояние. Триплетный хлорофилл может пере­давать свое возбуждение на ³О₂, превращая его в ¹О₂. Свойствами фотосенсибилизато­ров обладают и другие порфирины, а также их предшественник б-аминолевулиновая кислота. Эти свойства также проявляют все производные флавина.

Рис. 2. Образование АФК в электрон-транспортной цепи хлоропластов (по: Asada, 2006).

P680 и P700 — возбужденные молекулы хлорофилла; PQ и PQH₂ — окисленный и восстановленный пластохинон, соответственно; Q_A и Q_B — хиноны, принимающие электроны от хлорофиллов в фотосистеме II (ФС II); Фд — ферредоксин; A₀, A₁, F_X, F_A, F_B — акцепторы электронов от возбужденного хлорофилла в фотосистеме I (ФС I); ПЦ — пластоцианин, СОД — супероксиддисмутаза

Кроме того, растения синтезируют широкий спектр вторичных соединений, ге­нерирующих синглетный кислород на свету. Такие соединения локализуются в ваку­олях и не причиняют вреда самим растениям, но защищают их от растительноядных животных. Яркий пример — гиперицин. Это фенольное соединение накапливается у лекарственного растения Hypericum perforatum (зверобоя продырявленного). Из­вестно, что поедание скотом на пастбищах зверобоя в больших количествах приво­дит к тяжелым поражениям кожи из-за свободнорадикальных реакций окисления, которые вызывает гиперицин, возбуждаясь под действием солнечных лучей. Не слу­чайно растение называется зверобоем. Передозировка гиперицина, используемого как антидепрессант, опасна и для человека.

У животных роль фотосенсибилизаторов играют рибофлавин, миоглобин, про­топорфирин. Возбуждаясь под действием света, они приводят к образованию ¹О₂ в кожных покровах и органах зрения.

1.4. Генерация АФК в электрон-транспортных цепях хлоропластов и митохондрий

Главный источник АФК у растений — электрон-транспортная цепь хлоропла­стов, а у животных — электрон-транспортная цепь митохондрий.

Реакция образования супероксид-радикала в хлоропластах называется реак­цией Мелера. Фотовосстановление молекулярного кислорода до пероксида водоро­да (Н₂О₂) было открыто Аланом Мелером в 1951 г. Двадцать лет спустя Кози Аса­да с соавторами выяснили, что первичным продуктом восстановления кислорода является супероксид-радикал, который затем превращается в Н₂О₂ (рис. 2). Одно­электронное восстановление О₂ происходит за счет ферредоксина (Фд) — белка, со­держащего железосерные кластеры. Эта реакция является побочной в нормальном

процессе двухэлектронного восстановления NADP⁺, катализируемом ферредоксин:

NADP+редуктазой.

В митохондриях супероксид-радикал образуется в комплексах I и III (рис. 3).

Восстановление кислорода в комплексе I может происходить в результате передачи электронов от восстановленного флавинмононуклеотида (ФМН), а также от железо­серных кластеров. В комплексе III основным продуцентом супероксид-радикала яв­ляется Q-цикл (рис. 4).

Функционирование Q-цикла — важный способ создания градиента рН на со­прягающих мембранах митохондрий и хлоропластов. Восстановленный кофермент QH₂ (убихинол) в сайте своего окисления (Qo-сайте), расположенном на наружной, обращенной в межмембранное пространство стороне сопрягающей мембраны ми­тохондрий, передает один электрон на железосерные кластеры (Fe—S) белка Риске и далее в комплекс IV, а второй электрон — на низкопотенциальный гем цитохрома b₅₆₆ (b_L), затем на высокопотенциальный гем цитохрома b₅₆₂ (b_H), который способен восстанавливать окисленный убихинон (Q) до семиубихинона (QI Г) и затем до уби- хинола на внутренней стороне мембраны (в Qi-сайте), обращенной в митохондриаль­ный матрикс.

В результате двух оборотов этого цикла два убихинола окисляются в Qo-сайте, один восстанавливается в Qi-сайте, два электрона передаются в комплекс IV, два про­тона выкачиваются из матрикса и четыре протона закачиваются в межмембранное

Рис. 3. Образование АФК в электрон-транспортной цепи митохондрий (по: Ohta, 2012).

 

 

Рис. 4. Образование АФК в Q-цикле электрон-транспортной цепи митохондрий

 

пространство. Таким образом, в результате окисления одного убихинола достига­ется увеличение протонного градиента между внутренней и наружной сторонами сопрягающей мембраны на шесть протонов и увеличение разности потенциалов на мембране на два отрицательных заряда за счет двух электронов, перемещающихся из межмембранного пространства в матрикс.

Семиубихинон, как видно из приведенного описания, образуется в Qi-сайте

как промежуточный продукт восстановления в этом сайте убихинона до убихино-

ла. Однако в результате ряда побочных реакций семиубихинон возникает также и в Qo-сайте. Именно здесь, как было недавно установлено, происходит образование супероксид-радикала в результате передачи одного электрона от семиубихинона на молекулярный кислород.

1.5. Генерация АФК NADPH-оксидазами плазматической мембраны

Мощными продуцентами супероксид-радикала у животных и растений являют­ся расположенные в плазматической мембране NADPH-оксидазы, которые окисля­ют NADPH на цитозольной стороне, а электроны переносят на О₂, находящийся на внешней стороне мембраны, превращая его в супероксид-радикал. Впервые актив­ность этого фермента была обнаружена у фагоцитов крови млекопитающих, способ­ных реагировать на бактериальные клетки «окислительным взрывом» (respiratory burst) — массированным выбросом в область контакта с патогеном активных форм кислорода. Ферментативный комплекс состоит из шести субъединиц, включая содер­жащую цитохром b₅₅₈ субъединицу gp91-PHOX (gp —glycoprotein, 91 — 91 kilodalton, PHOX — phagocytic oxidase).

В 1990-е годы было показано наличие у растений белков, гомологичных gp91- PHOX фагоцитов крови млекопитающих. В дальнейшем эти белки были деталь­но охарактеризованы методами молекулярной биологии. Растительные гомологи NADPH-оксидаз фагоцитов кодируются семейством генов Rboh (respiratory burst oxi­dase homologs), экспрессия которых связана с реакцией «окислительного взрыва» на атаку фитопатогенов.

NADPH-оксидазы растений состоят из одной полипептидной цепи, включаю­щей 300 аминокислотных остатков, которая в форме а-спиралей шесть раз пересе­кает плазматическую мембрану (рис. 5). На цитоплазматической стороне находится NADPH-связывающий домен. В состав белка входят ФАД и два гема, представленные цитохромом b₅₅₈. Гемы находятся внутри мембраны и связаны с белком с помощью четырех консервативных остатков гистидина (H). В отличие от NADPH-оксидазы фагоцитов, растительный фермент имеет длинный гидрофильный N-конец. На этом конце, расположенном на цитоплазматической стороне мембраны, имеются две EF-руки, способные связывать Ca²+.

Рис. 5. Строение NADPH-оксидазы плазматической мембра­ны растений (по: Sagi, Fluhr, 2006)

У арабидопсиса имеется десять генов Rboh, экспрессия которых сильно различа­ется. Некоторые гены экспрессируются конститутивно, другие — в зависимости от стадии развития, третьи — в ответ на различные стрессовые воздействия (гипоксию, атаку фитопатогенов, засоление). Эти ферменты выполняют множество функций. Наиболее изучена их роль в реакции окислительного взрыва в апопласте, вызывае­мой фитопатогенами, засолением и гипоксией, в АБК-зависимом закрывании устьиц и в процессе формирования корневых волосков.

Вырабатываемый Rboh супероксид-радикал может иметь непосредственное защитное значение в качестве компонента окислительного взрыва. Кроме того, он может служить сигналом, вызывающим глубокие перестройки функционирования клетки, важные не только для адаптации, но и для процессов роста и развития.

Сигнальная функция супероксид-радикала тесно связана с кальциевой сигнали­зацией. Наиболее ярко это показано на примере формирования корневых волосков и АБК-зависимого закрывания устьиц. Формирование корневых волосков происхо­дит благодаря полярному, верхушечному росту отдельных клеток ризодермы корня. Верхушечный рост связан с входом Ca²⁺ в клетку на ее «верхушке» и с локализован­ной здесь везикулярной секрецией. С помощью флуоресцентного красителя, чувстви­тельного к АФК, было показано, что в процессе образования корневого волоска, за­нимающем примерно один час, в его растущем кончике генерируются АФК.

Мутанты арабидопсиса rhd2 (root hair defective) имеют короткие утолщенные корневые волоски и корни вместо длинных и тонких. У этих мутантов нарушен про­цесс генерации АФК и поглощения кальция в кончике корневого волоска. Белок RHD2 оказался NADPH-оксидазой плазматической мембраны (AtRboh С). Если кор­ни растения дикого типа обработать ингибитором этого фермента, то можно полу­чить фенокопию мутанта. Напротив, если корни мутанта обработать гидроксил-ра­дикалом, то на их поверхности возникнут вздутия, в какой-то мере имитирующие корневые волоски. Генерируемые RHD2 активные формы кислорода могут вызывать активацию потенциалзависимых Ca²+-каналов плазматической мембраны, через ко­торые в клетки входит кальций. Высокая активность RHD2 наблюдается и в зоне рас­тяжения корней, где также интенсивно поглощается Ca²⁺, необходимый для растяже­ния клеток.

С активностью NADPH-оксидазы плазмалеммы связана реакция закрыва­ния устьиц в ответ на АБК. Под действием АБК происходит активация AtRbоh В и AtRbоh F, которые вырабатывают АФК, что приводит к открыванию потенциалза­висимых Ca^-каналов плазмалеммы и входу Ca²+ в клетку. Повышение концентрации Ca²+ в цитоплазме, в свою очередь, увеличивает активность NADPH-оксидазы плаз­матической мембраны благодаря связыванию Ca²+ с EF-руками фермента.

1.6. Генерация АФК пероксидазами

Пероксидазы растений относятся к III классу (ЕС 1.11.1.7) суперсемейства рас­тительных, бактериальных и грибных пероксидаз, содержащих геминовое железо. Пероксидазы этого класса иначе называют гваяколпероксидазами, так как они наи­более активны по отношению к фенолам и эту активность in vitro часто тестируют, используя цветную реакцию окисления гваякола. Их также называют секреторными пероксидазами, так как они локализованы преимущественно в клеточных стенках и вакуолях. Ниже, описывая пероксидазы III класса, мы будем называть их просто пероксидазами.

Давно известно, что пероксидазы накапливаются в клеточных стенках старею­щих тканей. Они могут проявлять пероксидазную и оксидазную активность, исполь­зуя в качестве акцептора электронов пероксид водорода и молекулярный кислород, соответственно. Важная особенность каталитической активности этого фермента со­стоит в производстве свободных радикалов, которые могут вступать в спонтанные реакции. Протекание этих реакций зависит от присутствия в среде Mn²⁺ и фенольных кофакторов. Некоторые интермедиаты и продукты свободнорадикальных реакций также являются субстратами пероксидазы. Множество параллельно протекающих каталитических и спонтанных реакций отчасти объясняет необычно большое раз­нообразие реакций, катализируемых пероксидазами.

В процессе своей каталитической активности фермент находится в нескольких состояниях, с разной степенью окисленности молекулы. Молекулярные состояния фермента можно легко идентифицировать по различиям в спектре поглощения види­мого света. В классическом пероксидазном цикле нативный фермент E(Fe³⁺) вначале взаимодействует с Н₂О₂ и переходит в соединение I — E(Fe³⁺O). Далее окисленный фермент восстанавливается в результате двух последовательных одноэлектронных окислений фенольного субстрата (PhOH), превращаясь вначале в соединение II — E(Fe³⁺O^-) — и затем возвращаясь в исходное нативное состояние (ground state):

E(Fe³+) + Н₂О₂ E(Fe³+O) + Н₂О,

E(Fe³+O) + PhOH E(Fe³+O^-) + PhO\

E(Fe³+O^-) + PhOH E(Fe³+) + PhO ^ + Н₂О.

Таким образом, классический пероксидазный цикл обеспечивает протекание

следующей реакции: 2PhOH + Н₂О₂ 2PhO ^ + 2Н₂О.

Феноксильные радикалы (PhO ^), как правило, гасятся, взаимодействуя друг с другом и образуя димеры, олигомеры или такой полимер, как лигнин.

Пероксидазная реакция может протекать без кофакторов. Если в среде инкуба­ции присутствуют сильные восстановители, то феноксильные радикалы могут вос­станавливаться за их счет и таким образом выступать в роли кофакторов окисления пероксидазами этих восстановителей. Наиболее яркий пример такого окисления представляет реакция окисления гваяколпероксидазой аскорбиновой кислоты. В от­сутствие фенолов гваяколпероксидаза окисляет аскорбиновую кислоту с очень низ­кой скоростью. При добавлении фенолов, например феруловой кислоты, скорость окисления аскорбиновой кислоты возрастает в сотни раз. Таким образом, аскорби­новая кислота вызывает лаг-фазу в реакции окисления фенолов пероксидазами, про­должительность которой определяется количеством аскорбиновой кислоты в реак­ционной среде.

Некоторые восстановители, подвергаясь одноэлектронному окислению перок- сидазой в форме соединений I и II, превращаются в свободные радикалы, вступаю­щие во взаимодействие с молекулярным кислородом и таким образом генерирующие АФК. Это происходит при окислении пероксидазами NAD(P)H, салициловой кисло­ты, некоторых ароматических аминов, хитоолигосахаридов. Наиболее полно изучен процесс окисления NADH, состоящий из 8 основных реакций:

NADH + О₂ NAD+ + Н₂О₂, (1)

E(Fe³+) + Н₂О₂ E(Fe³+O) + Н₂О, (2)

E(Fe³+O) + NADH E(Fe³+O^-) + NAD ', (3)

E(Fe³+O^-) + NADH E(Fe³+) + NAD ', (4)

NAD ' + O₂ NAD+ + О2, (5)

NADH + О2^- NAD ' + Н₂О₂, (6)

О ' ₂ + О ' ₂ О₂ + Н₂О₂, (7)

E(Fe³+) + О2 E(Fe³+O2^-). (8)

Для «затравки» требуются следовые количества Н₂О₂, которые возникают в про­цессе спонтанного окисления NADH в водном растворе (1). Далее следуют реакции

классического пероксидазного цикла (2-4), в результате которых образуются ради­калы NAD ^', вступающие в реакцию с молекулярным кислородом и генерирующие О ' ₂^- (5). Супероксид-радикал окисляет NADH и превращается в Н₂О₂ (6), который ис­пользуется в реакциях пероксидазного цикла (2-4). Реакция (6) многократно уско­ряется ионами Mn²⁺. Поэтому в присутствии Mn²⁺ окисление NADH пероксидазой протекает во много раз быстрее. Кроме того, в реакционной среде наблюдается спон­танная дисмутация О ' ₂^- (7). В итоге протекания этих реакций NADH окисляется до NAD⁺, а O₂ восстанавливается до Н₂О₂:

NADH + О NAD+ + НО.

2 2 2

Осуществлению классического пероксидазного цикла во время окисления NADH препятствует то, что фермент под действием О ' ₂^- переходит в форму соединения III (8), неактивного в пероксидазном цикле. Возвращение фермента в нативную форму происходит спонтанно или с помощью Н₂О₂, однако очень медленно. В последнем случае пероксидаза, вначале переходя с помощью О'₂^- в соединение III, а затем возвра­щаясь в нативную форму, фактически катализирует реакцию Хабера—Вайса:

О2^- + НО O + ' ОН + ОН^-.

² 2 2 2

Выход из соединения III возможен также при участии NAD ^':

Е(Бе³⁺О2^-) + NAD ' E(Fe³+O) + NAD+ + Н₂О.

В присутствии некоторых фенолов окисление NADH многократно усиливается из-за того, что фенолы могут:

1) возвращать соединение III в нативный фермент:

Е^е³⁺О2^-) + PhOH E(Fe³+) + PhO ' + Н₂О₂;

2) окисляться пероксидазой до феноксильных радикалов, которые, взаимодей­ствуя с NADH, восстанавливаются, производя новые радикалы NAD ^'.

В качестве фенольного кофактора в реакции in vitro обычно используется 2,4-ди­хлорфенол. Природными кофакторами NADH-оксидазной реакции, по-видимому, служат содержащиеся в клеточных стенках фенольные соединения: р-кумаровая, фе- руловая, синаповая кислоты и их спирты. Остается также открыт