Потенциал apicoplast в качестве мишени для лекарственного средства, отражает его происхождение водорослей, с большим количеством белков и путем-способами не разделяет человеческий организм. Кроме того, многие apicoplast белки представляют собой ферменты, которые связывают небольшие молекулы и, следовательно, имеют более высокую-ность Возможности поиска быть druggable (Хопкинс и Groom, 2002). В самом деле, некоторые из прокариотических-подобных особенностей apicoplast функций можно ингибировать с помощью существующих соединений. Они были важными инструментами исследования, а некоторые из них важны клинически, а также. Способность ингибиторов органелл ДНК репликации Тион, транскрипции и трансляции, чтобы убить Т. гондий и П. фальципарум показывают, что органелл функции имеют важное значение. Например, рифамицинового S antibi-otics, такие как рифампицин и рифабутин, ингибируют эубактерий РНК-полимеразы, как те, кодируемый apicoplast геномов, и являются активными против обоих T. гондий и Plasmodium видов (Алджер и др, 1970;.. Диво и др, 1985;. Страт и др, 1993;. Араухо и соавт, 1994;. Olliaro и др, 1994;. Pukrittayakamee и др, 1994). Обе субъединицы А и В П. фальципарум ДНК-гиразы медведь apicoplast ориентации последовательностей (Хорь и др., 2005), а также ингибиторы ДНК-гиразы являются токсичными для T. гондий (Фикеры и Roos, 1997).
Т. гондий чувствительно к макролидному антибиотику клиндамицину, ингибитор прокариотического-подобной transla-ции, и гондий мутанту, устойчивому к Т. клиндамицину был кросс-резистентно к азитромицину макролидных антибиотиков и спирамицину (Pfefferkorn и Borotz, 1994). Были обнаружены два других клиндамицин устойчивых к T.gondii, мутантов иметь точку MUTA-ции в пластидах большой субъединицы рРНКа, которая отображается
| APICOPLAST |
близко к известному клиндамицину специфичность установ-nants (лагерь и др., 2002). Макролидные сайты взаимодействия, как известно, должно быть ограничено небольшой областью домена пептидилтрансферазного рибосомы, и со-кристаллизации этих препаратов с рибосомами показали, что все они блокируют пептид, выходной туннель (Hermann, 2005). Следовательно, наблюдаемое поперечное сопротивление неудивительно.
Другие ингибиторы прокариотического-типа перевода включают в себя тиострептон, который действует в отношении P. Falci-parum (МакКонка и соавт, 1997;. Clough и др, 1997;. Роджерс и др., 1997), но не Т. гондии. Дифференциальная чувствительность, вероятно, связано с альтернативным нуклеотида в критической позиции в Т. гондий apicoplast большой субъединицы рРНК (Clough и др., 1997). Актинонин антибиотик ингибирует пептид deformylase, который удаляет формильную группу из инициатора метионина в эубактерий белков. Это показывает некоторую активность в отношении P. малярийного в пробирке, вероятно, действует против один или оба apicoplast или mitochon-drion (Rohrich и др., 2005). Тетрациклины, которые ингибируют перевод по прокариотических и прокариотической-подобных рибосом, уменьшают рост как Т. гондий (Tabbara и др, 1982;. Chang и др, 1990, 1991.) И
малярийный плазмодий (Tabbara и др, 1982;. Гири и Jensen, 1983;. Divo и др, 1985). Эти антибиотики связываются с малой субъединицы рибосомы (Бродерсен и др., 2000;. Анохина и др, 2004), и было высказано предположение, что в apicomplexans, митохондриальные рибосомы является основным местом действия, на основе его последствий на митохондриальных функций и картины ингибирования синтеза белка в
Т. гондий и П. фальципарум (Kiatfuengfoo и др., 1989,. Beckers и др, 1995). Тем не менее, лагерь и др. (2002) сообщили, что кинетика Т. Gondii роста inhi-bition по клиндамицина и тетрациклина были очень похожи, в том числе и с отсроченным смерти фенотипа (см. Ниже) Таким образом, по-видимому, тетрациклины ингибирования трансляции белка в apicoplast в дополнение к или вместо митохондрии.
Хотя эффект на митохондрии часто не могут быть исключены, многие из препаратов, описанных выше явно влияют на apicoplast. Они показывают интересный эффект, отложенная смерть (Фикер и др., 1995). Примером может служить случай клиндамицин (рис 9.9A). После добавления лекарственного средства, паразит мульти-пликация продолжает энергично в течение первой вакуоли. Однако, при создании второго
A
| # Parasite удвоений |
В
| 7,0 | 7,0 |
| 6,0 | 6,0 |
| 5.0 | 5.0 |
| 4,0 | 4,0 |
| 3.0 | 3.0 |
| 2,0 | 2,0 |
| 1,0 | 1,0 |
| Время (ч) - первый цикл | Время (ч) | - второй цикл |
фиг 9.9 Отложенная смерть фенотип.
(A) Кинетика замедленной смерти. Т. гондий внутриклеточные тахизоиты обрабатывали ципрофлоксацина (25ìМ, квадраты) или клиндамицин (1 ìМ, кружки) и их рост по сравнению с необработанными паразитами (крестики). Левая график показывает рост в пределах первого вакуоль, где не было замечено никакого существенного влияния. После лизиса и входа в следующей клетке-хозяина (правый) граф, паразиты, обработанное лекарство умирают или нет ципрофлоксацин препарата присутствует (закрытые квадраты) или удалено (открытые квадраты). Изображение предоставлено ME Фикеры и DS Руса (1997) Nature 390, 407, перепечатано разрешения Macmillan Publishers Ltd.
(B) Replication without apicoplast division. T. gondii were transiently transfected with ACP-GFP-mROP1 and inoculated into an HFF cell monolayer. This image, taken 48 h after transfection, shows a vacuole with about 64 parasites, only 1 of which contains an apicoplast as shown by the fluorescence of the GFP reporter. Bar çíàê ðàâíî 5 ìм. Изображение предоставлено CY Он и DS Roos (2001), EMBO J 20, 330, перепечатано с разрешения от EMBO J. Эта цифра воспроизводится в цвете в секции цвета пластины.
226 APICOPLAST И митохондрия токсоплазма
вакуоль, паразиты не в состоянии. Этот эффект имеет место, даже если препарат будет удален во втором цикле. Явление отсроченной смерти было дополнительно исследовано с помощью необычной системы для генерации apicoplast-дефицитные клеток (Он и др., 2001о). был найден Переходный transfec-ции конструкции, содержащей ACP-GFP, слитый с rhoptry нацеливания последовательностей ROP1 мешать разделению apicoplast. После ряда подразделений, то паразитофорная вакуоль содержит много паразитов, но только один с apicoplast. В оригинальной вакуоли клетки оставались здоровыми содержали ли они apicoplast или нет (рис 9.9B), и все они были Капа-BLE во вторжении новую клетку-хозяина. Однако, только те, с apicoplast может размножаться в новом хозяине. Следовательно, оказывается, что некоторые молекулы, полученные прямо или косвенно apicoplast в предыдущем цикле должны в следующем раунде инфекции. был определен по крайней мере один молекулярный дефект связан с отсроченной смерти. Уровень apicoplast ДНК резко снижается при обработке Clin-damycin (Фикер и др., 1995; Фикер и Roos, 1997). Очевидно, что неспособность перевести определенные белки, кодируемые геном apicoplast препятствует надлежащему репликацию ДНК, либо непосредственно, либо, более вероятно, косвенно.
Некоторые из антибиотиков, которые нацелены на apicoplast функции используются клинически. Антибиотик Clin-damycin используются в качестве второй линии лекарственного средства для токсоплазмоза, в то время как спирамицин выбран для токсоплазмоза во время беременности. Тем не менее, некоторые из агентов, будучи эффективным в пробирке, не являются достаточно противопаразитарными для применения в лечении заболевания. В недавнем обзоре экстенсивно обсудили apicoplast в качестве мишени лекарственного средства в apicomplexan заболеваний (Wiesner и Seeber, 2005), и тема также рассматривается в главе 19 настоящего тома.
Apicoplast метаболизм
Какие функции потенциально локализуется в apicoplast? Как было отмечено выше, apicoplast геном не кодирует никаких белков, которые обеспечивают ключи к его метаболической роли. Большинство генов кодируют белки, необходимые для транскрипции или трансляции. Потенциальный ортолог ClpC (а шаперон компоненты комплекса крестиков) кодируются 35-кб элемента.
Один ген (первоначально названный ORF470, затем ycf24, и теперь доста B) был первым подумал кодировать переносчик ABC, но в последнее время было предложено принять участие в обмене железа (Рангачари и др., 2002; Wilson и др., 2003). Следовательно, большинство из ключей к apicoplast функции происходит из предсказанных белков NEAT. Использование PlasmoAP, Ральф и др. (2004) выявили более 500 P. Falciparum белков как потенциально таргетинг на apicoplast. Идентификация созвездия потенциальных apicoplast белков дают подсказки относительно того, почему органелла имеет важное значение. Тем не менее, около 70 процентов прогнозируемой NEAT белков с неизвестной функцией, аннотируемым в качестве гипотетических белков (Ralph и др., 2004). Дальнейший анализ будет необходим, чтобы определить, какие из этих предсказанных белков выражены и ориентированы на apicoplast.
До сих пор, данные П. фальципарум не были систематически по сравнению с Т. гондий предсказал белки. Тем не менее, как и генетические системы в apicoplast, большинство NEAT белков, вероятно, будут цианобактерий по происхождению, с эволюционной историей, который не пересекается с тем из человеческого организма. Поэтому многие из этих путей будут, если важно, обеспечить отличные потенциальные лекарственные цели. Некоторые из функций, отображенных на apicoplast уже экспериментально доказано, что существенно за счет использования ингибиторов или имеют высокую вероятность быть существенным, учитывая их биологическое значение. Краткое изложение мета-Болич путей предсказанных или демонстрируемых проживать в apicoplast приведена на рисунке 9.10.
Ацил белок-носитель, часть II типа жирной кислоты биосинтез пути, была одним из первых белков, признанных быть направлено на apicoplast (Валлер и др., 1998). Типа II, путь, типичный для растений и водорослей, опосредуются рядом отдельных ферментов, все из которых были идентифицированы в геномах П. Т. и тропической гондий. В отличии от этого, типа я путь, используемые млекопитающими опосредуются один большой многодоменной молекулой. Сканирование базы данных гондий генома T. показывает, что паразиты также содержат ген, кодирующий белок, связанный с этой молекулой многодоменной (именоваться Crawford и Руса, неопубликованный, в Визнере и Seeber, 2005). Хотя очевидно, что Т. гондий может занять до жирных кислот из клетки-хозяина и, возможно,
| APICOPLAST |
| Транспортеры | |
| Lipoylation | кластеры Fe-S |
| окислительно-восстановительный потенциал | изопреноидами |
| гем | Жирные кислоты |
окислительно-восстановительный потенциал
гем
кластеры Fe-S
Lipoylation
Электронный транспорт
Рис 9,10 Метаболизм apicoplast и митохондрии. Несколько метаболических путей были связаны с apicoplast (изображен с четырьмя мембранами) и митохондрии (изображен с двумя мембранами), на основе предсказанных таргетинга последовательностей. Для некоторых, локализация соответствующих ферментов в органеллы была подтверждена экспериментально. Два различных путей синтеза биосинтеза кластеров Fe-S-видимому, присутствуют. В противоположность этому, биосинтез гема требует collabo-рацион ферментов в двух органелл, а также в цитозоль.
используют тип I путь к синтезировать дополнительные жирные кислоты, новые данные свидетельствуют о том, что путь второго типа является существенным (Bisanz и др., 2006). Thiolactomycin, который ингибирует путь II типа для синтеза жирных кислот у бактерий, может ингибировать рост и
Т. гондий и P. фальципарум (Валлер и др., 1998; неопубликованные данные, приведенные в Макфадден и Roos, 1999). Точно так же, триклозан, который ингибирует еноил-АСР-КоА-редуктазы (который опосредует последнюю стадию в цикле синтеза жирных кислот) убивает и T. гондий и P. Falci-parum (McLeod и др., 2001; Perozzo и др., 2002). Интересно отметить, что П. фальципарум отсутствует тип I путь-путь. И наоборот, Cryptosporidium parvum имеет
только я путь типа (Zhu и др., 2004). Это наблюдение коррелирует с очевидным отсутствием в apicoplast культуры C.parvum (Риордан и соавт, 1999;. Zhu и др, 2000a;.. Keithly и др, 2005), а также отсутствие
из apicoplast-кодируемых и аккуратных генов в parvum (C. Абрахамсен и др., 2004) и Cryptosporidium HOMINIS (Xu и др., 2004), а также отсутствие генов Cryptosporidium, соответствующее известное apicoplast путей.
Ацетил-СоА необходим для синтеза жирных кислот, и генерируется из пирувата с действием мультиензимной комплекса пируватдегидрогеназы. Недавние исследования показали, что Т. гондий и П. фальципарум обладают генов, кодирующих субъединицы для apicoplast пируват-дегидрогеназы, даже если они не имеют митохондриальную форму (Фот и соавт, 2005;.. McMillan и др, 2005). Первый шаг в производстве жирных кислот из ацетил-КоА катализирует ацетил-СоА-карбоксилазы (АСС). Пластидных РДЦ ингибируются арилоксифеноксипропионатов гербицидов, и рост Т. гондий ингибируется этих соединений (Zuther и др., 1999). Есть два T.gondii, РДЦ; один цитозольная, а другие было идентифицированы и локализованы в apicoplast (Jelenska и др., 2001).
Изопреноидный синтез другой путь местной роскопии к apicoplast. Ферменты, опосредующие этот путь отличны от тех, мевалонатного пути для синтеза изопреноидов, найденного в организме человека. Паразита путь, называемый DOXP путь для его раннего промежуточного 1-дезокси-D-ксилулозу 5'фосфат, был более тщательно изучен П. малярийного. Fosmidomycin, анти-биотических, который ингибирует DOXP редуктазы, токсичен для паразита малярии (ДЖОМАА и др., 1999). Тем не менее, это показывает слабую активность против T.gondii, несмотря на наличие гена редуктазы Т. гондий DOXP. Сопротивление может возникнуть в результате определенных изменений в мишени или отсутствии биодоступности.
Как субстраты для этих путей ввода apicoplast? По аналогии с хлоропластами, вполне вероятно, что конкретные носители необходимы. Малярийный паразит обладает два сахарофосфатными трансом-носильщиков, одна из которых несет apicoplast направл ющую последовательность, которая может опосредовать поглощение субстратов (такие как глицеральдегид-3-фосфат или фосфоенолпируват) в пластиды (Маллина и др., 2006). Анализ генома T. Gondii в 10× Покрытие предполагает одну сахарофосфатного
228 APICOPLAST И митохондрия токсоплазма
Транспортер присутствует (Karnataki и др., неопубликованные результаты). Это является сложной задачей, чтобы предсказать специфичность этого переносчика на основе последовательности в одиночку, а в некоторых случаях пластид сахарофосфатного transloca-ров транспортировки нескольких субстратов, хотя и с разной аффинностью (Knappe и др., 2003).
Системы аксессуаров, необходимые для выполнения функций указанных выше биосинтетических процессов также должны находиться в apicoplast. Система окислительно-восстановительный присутствует, состоит из ферредоксина и его партнер ферредоксин-НАДФ+редуктазы (Фолльмер и др., 2001). Ferre-doxin редуктаза наиболее сходна с нефотосинтетическими тканями растений, которые обеспечивают восстановительные эквиваленты для биосинтетических процессов. В apicoplast, НАДФН является необходимым кофактором для DOXP редуктазы в изопреноидах синтеза и для КАР (FabG) фермента, участвующего в биосинтезе apicoplast жирных кислот. Lipoylation необходим для активности дегидрогеназы комплекса пируваты, и Т. гондий делает обладает apicoplast-мишенью синтазов липоевых кислот (Thomsen-Zieger и др., 2003). Биосинтез жирных кислот требует действи ацетил-СоА-карбоксилазы, который содержит Кова-lently придает биотин протезного группу. Группа биотина может быть визуализированы с FITC-меченного strepta-Vidin и совместно локализуется с apicoplast маркеры, подтверждающие предсказанную локализацию (Jelenska и др., 2001).
Кластеры железо-сера выполняет различные функции в белках, в первую очередь облегчая перенос электронов. Некоторые из белков, которые находятся в apicoplast содержат Fe-S кластеров, в том числе Ferre-doxin и ферментов GcpE (IspG) и LytB (IspH), участвующих в последних этапах синтеза изопреноидов. синтазы Липоевая кислота является также белок Fe-S. Железо- кластеры серы не образуют спонтанно - они требуют действия нескольких белков для их эффективного образования. Seeber (2002) недавно обобщены данные по генерации кластеров Fe-S в apicomplexans и контрастируют его с теми, у других видов. Серия REAC-ции высоко консервативны. Поколение элементарной серы из цистеина опосредуется
действие цистеина desulfurase, и его восстановление в сочетание с окислением железы (приносимым в сидерофоре) на конкретном белковый помосте. Дополнительные белки необходимы для высвобождения Fe-S кластеров из каркаса, и их коор-нации с другими белками. Ферредоксин необходим для восстановительных стадий, а также несколько дополнительных белков, также имеют важное значение. Компартментализация этих реакций, вероятно, полезная из-за образование активных промежуточных продуктов. Таким образом, повреждение других клеточных компонентов можно избежать. В большинстве эукариот, синтез кластера Fe-S происходит в митохондрии. Последние работы указывает на то, что apicoplast, вероятно, будет местом для синтеза кластеров Fe-S. Apicoplast кодируются ORF470 гомологична, если не ортологами, чтобы sufB (Wilson и др., 2003), которая лежит в одной и тот же бактериальном опероне в качестве других генов, участвующих Fe-S биосинтеза у бактерий (Начин и др., 2001, 2003). Гены, кодирующие другие белки, вероятно, будут участвовать в синтезе кластеров Fe-S были идентифицированы в P. малярийного, и некоторые из них были использованы для прогнозирования apicoplast таргетинга последовательности (Эллис и др., 2001).
Биосинтез Гема является еще одним органеллами процесса в эукариоте, происходящий в митохондрии человеческого организма. Еще раз, секционирование может служить для защиты клетки от потенциально опасных промежуточных продуктов или побочных продуктов. В APICOM-plexaus, биосинтез гема достигается за счет метаболического взаимодействия между apicoplast и митохондрии. Все восемь ферментов, необходимых для синтеза де ново гема присутствуют в геноме P. малярийного (Гарднер и др., 2002). Фермент, опосредующим первый шаг в пути являетсяδсинтаза аминолевулиновой кислоты. Он содержит предсказанную митохондриальную направл ющую последовательность, и, паразитов малярии, слитые с GFP этой последовательности ориентированы на mitochon-drion (Sato и Wilson, 2002; Sato и др., 2004). Следующие два ферментов в пути, porpho-bilinogen синтазы и гидроксиметилбилан-синтазы, имеют двудольные лидерные последовательности, и GFP слитых ориентированы на пластиды (Сато и др., 2004). Порфобилиногена синтазы принадлежит к цианобактерий / пластид клады (Obornik и Green, 2005), как и ожидалось для пластид-целевой белок. Тем не менее, те же авторы отмечают, что два фермента
| митохондрии |
функционирующий в конце пути, порфобилиноген деаминаза и уропорфириноген декарбоксилазе, не локализован в этом кладе (Obornik и Green, 2005). Тем не менее, последний имеет предсказанную последовательность apicoplast ориентации (Сато и др., 2004). Филогенетический вывод указывает на то, что apicomplexan феррохелатазы, последний фермент в пути, эволюционно кластеры с красной водорослей и proteobacterial последовательностей. Его местоположение не определено экспериментально, но предполагается быть митохондриальной (Sato и др., 2004). Разнообразие в эволюционном происхождении этих ферментов иллюстрирует мозаичную природу apicomplexan генома.
Митохондрии
В удивительном противоречии с apicoplast, сравнительно мало известно о митохондрии Toxoplasma. Это относительное пренебрежение отчасти отражает новизну эффекта apicoplast, возможно, отвлечь внимание от более мирских эндосимбиотических органелл в паразите. Еще больше демпфера на митохондриальном исследовании в Т. гондий был неожиданной трудностью определения митохондриального генома в этом пару-сайте. Тем не менее, ультраструктурному, Т. гондий имеет обычный протозойных митохондрии: одно-, двух--membraned органелл на клетку, с тубу-лар, а не пластинчатую крист (рис 9.1).
Evolution
Филогенетические анализы apicomplexan Мито-chondrial геномов были сосредоточены на взаимоотношениях внутри родов и ассоциации паразита и хозяина видообразования (Rathore и др., 2001; Джой и др, 2003;. Jongwutiwes и др, 2005;.. Mu и др 2005). Большинство этих исследований сравнили виды Plasmodium, но все большее число APICOM-plexan митохондриальных последовательностей генома может расширить эту деятельность. Тем не менее, ограниченное содержание генов этих геномов - только три генов белка и фрагментированного рибосомного РНК - ограничивает то, что вопросы могут быть рассмотрены и выводы сделаны. Следовательно, глубокие эволюционные корни
из apicomplexan митохондрии были относительно мало внимания.