15.5.2.1 Переходная трансфекция
• Cytomix (120 мМ КСl, 0,15 мМ CaCl2, 10 мМ К2HPO4/ KH2ПО4 рН 7,6, 25 мМ HEPES, рН 7,6, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ MgCl2) Могут быть получены в больших пакетах, стерилизовали фильтрованием и хранили в виде аликвот при -20°С или 4°С (ван ден Хофф и др., 1992).
• Взвешивают 12 мг АТФ и 15,2 мг глутатиона, добавить
в 10 мл cytomix и стерилизуют путем прохождения через 0.22-μм фильтр.
• Стерилизация ДНК путем осаждения этанолом. Отрегулировать 50μг плазмидной ДНК (как правило, в ~ 10 μземельные участки
очищали с использованием коммерческого набора плазмиды purifica-ции, такие как от Qiagen) до 100 μл с ТЕ (рН 8,0). Добавить 11μл 3М NaOAc и 250 μл этанола. Осадок ДНК в течение 5 минут при-20°C и спина на полной скорости в микроцентрифуге.
• Промывают осадок с 1 мл холодного 70% -ного этанола, осторожно переворачивая пробирку, и спина в течение 2 мин в микроцентрифуге.
• Перемещение труб в колпаке с ламинарным потоком и отбросить этанол (держать глаз на гранулу).
• Пусть испарится этанол в течение 5-10 минут (будьте осторожны, чтобы не «чрезмерно сухой», так как это может быть трудно
растворяться ДНК). Ресуспендируют ДНК в 100μл cytomix.
• Фильтр паразиты из свежеприготовленного лизированных T175 колбу в 50 мл полипропиленовую пробирку и считать т в гемоцитометра (развести образец в соотношении 1:10 в PBS для подсчета). Пелле паразиты в 1500 г,
20 мин, 4°С, и ресуспендируют в полной cytomix до 3,3 × 107 паразиты на мл (при необходимости, концентрация паразита может быть увеличена до восьми раз).
• Смешайте 100 μл плазмидной ДНК и 300 μл паразиты в 2 мМ зазор кювету для электропорации (Genetronix) и электропорации паразиты с одной
1.импульс 5 кВ, установка сопротивления 25 ΩИ установка конденсатора 25 μF, используя BTX ECM
630. При использовании электропоратора BioRad, установите его
1.5 кВ, 25 μF, и квадратные волны; если используя систему Amaxa, использовать решение Т-клетки вместо cytomix и установить электропорации CONDI-ции для программирования U33.
• Передача паразиты сразу в вырожденной Т25 HFF культуры (для отбора и биохимических экспериментов) или на покровные для микроскопии (см ниже).
• Экспрессия трансгена может быть обнаружена, начиная 8 часов после трансфекции (зависит от ING-трансгена и чувствительности анализа, используемого), достигая максимум около 36 часов после электропорации. Для измерения переходной эффективности трансфекции, электропораций с надежными и простыми в счет визуальных маркерами (например, плазмиды tubYFP-YFPsagCAT;. Gubbels и др, 2003). Инокулируйте покровные и подсчитать общее количество вакуолей и количество флуоресцентных вакуолей в течение нескольких полей. Все три electropo-rators выход переходных КПД 30-50 процентов через 24 часа после электропорации.
15.5.2.2 Выбор стабильных трансформантов
• КПП: выбор для хлорамфеникол ацетил
трансферазы (CAT) может начаться сразу же после электропорации в присутствии 20 μМ Chlo-ramphenicol (34 мг / мл стоковый в этаноле). Поскольку действие препарата задерживается, важно прохождения паразитов через каждые 2 дня
408 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МАНИПУЛИРОВАНИЕ токсоплазма
путем инокуляции по меньшей мере 106Паразиты, чтобы пул паразитов гетерогенной, насколько это возможно. Минимальное количество плазмиды требуется для создания стабильных трансформантов зависит от используемого вектора, но 10-50μг линеаризованной плазмиды, как правило, дают стабильные трансформанты.
• DHFR-TS: электропорации паразиты с 50 μг плазмиды, кодирующей лекарственной устойчивостью дигидро-фолат-редуктазы-тимидилатсинтазы аллель (Donald и Roos, 1993), такие как плазмиды
pDHFR * -TScABP (Sullivan и др., 1999). После электропорации, культуры в присутствии 1μМ пириметамин (1 μл 10 мМ исходного в этаноле). Эта плазмида приводит к высокой частоте преобразования (1-5 процентов). Будь осторожен обработки трансгенных линий, так как пириметамин используется в лечении человека токсоплазмоз.
• HXGPRT: этот выбор требует hypoxan-Thine-ксантин-гуанин-phosphoribosyltrans ferase нулевого мутанта (такие мутанты доступны в настоящее время для нескольких штаммов, см, например,
Дональд и др., 1996 для RH). Двадцать четыре часа после трансфекции добавляет 25μг / мл микофеноловой кислоты (25 мг / мл стоковый в этаноле) и 50 μг / мл ксантина (50 мг / мл исходного в 0,1 N КОН). MPA / ксантин должны убивать паразитов в течение 2-3 дней.
• BLE: (. Мессина и соавт, 1995) для выбора флеомицина, электропорации паразитов с помощью вектора экспрессии, кодирующего устойчивость маркера BLE, передавать в клетки HFF до полного лизиса принимающей культуры не происходит (12-24 часа). Лизируют культура вынуждена три раза через 25-га иглу, чтобы гарантировать, что все паразиты внеклеточные (смотрите раздел безопасности для опасений относительно иглы, проходящих перед использованием этого прото-COL). Суспензия паразитов регулируется
до 5 мг / мл флеомицина (исходный раствор: 20 мг / мл в воде и хранили при -20°С) и инкубировали при 37°С в течение 10 часов. Паразиты
переданы для восстановления в HFF культур в среде, содержащей 5 μг / мл флеомицина. После того, как новый цикл лизиса внеклеточные паразиты лечат снова в присутствии лекарственного средства в течение 10 часов, а затем с помощью клонированного предельного разведения в 96-луночных планшетах, содержащих
клетки HFF в присутствии 5 μг / мл флеомицина.
15.5.2.3 Ограничение фермента опосредованной интеграции (REMI)
Эффективность преобразования может быть повышена за счет добавления 50-100 U из BamHI, NotI, или SacII в кювету непосредственно перед электропорации (эти три фермента работали в прошлом, выбрать тот, который не режет существенную часть вашей плазмиды (ы)). Обратите внимание, что REMI часто приводит к мульти-копию интеграции плазмиды (ов) (Black и др., 1995; Gubbels и др., 2004).
15.5.2.4 Клонирование трансгенных линий с помощью предельного разведения в 96-луночных планшетах
• Семенные ткани-культура, обработанная 96-луночные планшеты с
HFF клеток и расти до слияния. Удалить среду и добавляют 100μл DMEM, 1% FCS, в каждую лунку.
• Урожай свеже лизированных паразитов путем фильтрации и центрифугирования, как описано выше.
• Граф, используя гематоцитометр, и разбавляют до 250 паразитов на мл.
• Добавить 100 μл (25 тахизоитов) в каждую лунку в первых и седьмых вертикальных колоннах.
• Использование многоканального pippetor выполнения последовательного разведения слева направо, передавая 100 μл при каждом шаге (смешать каждую лунку pippetting вверх и вниз три раза). Откажитесь среду после длинна-Инг колонке 6, и начать заново в строке 7.
• Выдержите в течение 7 дней, не нарушая культуру.
• Проверьте каждую строку слева направо, с использованием инвертированного микроскопа, и определить скважины, которые содержат одну металлическую пластинку. Отметьте эти скважины. Expand клоновых линии от прохода в колбу Т25.