Повышение уровня знания Т. гондий на молекулярном уровне, в значительной степени способствовали завершению проекта генома, в сочетании с быстрым прогрессом в развитии генетических инструментов для манипулирования паразита, сгенерировали oppor-tunities для создания новых ослабленных вакцин. Такие целевые подходы были использованы для создания паразитов с этапами неполными жизненного цикла, с пониженной пролиферативной способностью, или со сниженной вирулентностью. Мутантные паразиты были получены либо с необратимой делеции гена или, в последнее время, условно ингибирования или активации экспрессии необходимого гена. Генетически «Crip-паразиты» умолял были проанализированы в пробирке и в естественных условиях, чтобы характеризовать их мутантные фенотипы и определить, является ли ген, возможно, redun-DANT. В настоящий момент, инфекционность всех мутантов Toxoplasma, которые были получены с помощью обратной генетики только была проанализирована у мышей, а не в более крупных животных. Является ли потенциал вакцины или ее отсутствие продемонстрирована на мышах могут быть переведены на успех и неудачу в более крупных животных является предметом некоторой гипотезы. Например, в то время как штамм RH и неполный штамм S48 являются весьма смертельным для мышей, относительной влажности не является постоянным у свиней и вызывает защитный иммунитет при чал-lenge с ооцист (Dubey и др., 1994). Точно так же, неполный штамм S48 не сохраняется в любом другом животном до сих пор исследуемой и коммерчески используют в качестве живой вакцины. Таким образом, потенциал живого мутанта паразита не может быть определена только мышей, но в конечном счете, должны быть установлены в большем животного.
В течение последних 7 лет, различные генные токсоплазмов делеционные мутанты были получены - хотя цель, как правило, в том, чтобы получить дополнительно
понимание функции конкретного гена, а не для создания вакцины. Тем не менее, вполне вероятно, что любой биологически важный ген, будет способствовать пригодности и / или вирулентности паразита, и, следовательно, потенциальная вакцина из этих мутантов был значительный интерес (см таблицу 24.2):
• До сих пор наиболее перспективные вакцины мутант, который был сформирован, штамм RH с disrup-ного карбамоил фосфат синтетазы II (CPSII) (Fox и Bzik, 2002). CPSII является первым ферментом в метаболическом пути для де ново синтеза пиримидина (генерации строительных блоков для РНК и ДНК), и нарушая этот фермент сделанный токсоплазмы в зависимости от подаваемого извне урацил, который он может спасти. Срыв CPSII таким образом создал урацил ауксотрофа, который только вырос в пробирке, когда клетки-хозяева были дополнены урацил. При отсутствии урацила, CPSII нокаут-паразиты захвачена клетки-хозяева, как правило, но не Repli-Cate. Никакой рост не наблюдались (без добавления урацила) в пробирке и в естественных условиях. Инъекция мышей с CPSII нокаута паразитов не убивал BALB / C мышей,
• Поверхностные антигены (провисания) токсоплазменный также были направлены на удаление. Провисает, как полагают, участвуют в прикреплении хост-клеток и активации иммунного ответа хозяина. Основной тахизоят поверхностный антиген является SAG1, и был получены два типа SAG1 мутантов. Один из них был сделан химический muta-
генеза, а другой был недавно методами генной инженерии (ÄSAG1). Оба придают, ввести и пролиферируют приблизительно нормальные цены
внутри клетки-хозяева (Kasper и Хан, 1993; Mineo и Kasper, 1994;. Rachinel и др, 2004). ÄSAG1 тахизоиты были смертельными в восприимчивых мышей C57BL / 6 (хотя выживаемость слегка затянуто по сравнению с дикого типа мышей, инфицированных), но удаление SAG1 предотвратить острый илеит, когда тахизоиты непосредственно вводили в кишечник.
732 ВАКЦИНАЦИЯ ПРОТИВ ТОКСОПЛАЗМОЗ: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ
Таблица 24,2 штаммы токсоплазмы нокаутных и индуцировали иммунитет у мышей
| целевое | родительский | мышь | Выживание и / или | ||
| Ссылка | ген | штамм | дозировка | штамм | защитный эффект |
| Фокс и Bzik, 2002 | CPSII | RH | До 107 | BALB / с | Нет оружия, все |
| тахизоиты | уцелеть | ||||
| Защищает от | |||||
| летальной | |||||
| Rachinel и др., 2004 | SAG1 | RH | 104 тахизоиты * | C57BL / 6 | 30% снижение смертности |
| Dzierszinski и др., | SAG3 | RH | 20 тахизоиты | BALB / с | 85% снижение смертности |
| Сольдати и др., 1995 | ROP1 | RH | 50 тахизоиты | швейцарцы | летальный |
| Mercier и др., 1998 | GRA2 | RH | 10 тахизоитов | Швейцарский (CD1) | 50% снижение смертности |
| Bohne и др., 1998 | BAG1 | PLK ** | 104 тахизоиты | C57BL / 6 | Нет снижение смертности |
| Чжан и др., 1999 | BAG1 | PLK ** | 105 тахизоиты | Швейцарский (CD1) | Пять-кратно снижена |
| киста бремя | |||||
* Прикладываются через хирургические инъекции в кишечник.
** PLK является клоновым производным ME49.
C57BL / 6 является восприимчивой мышью, BALB / C представляет собой относительно устойчивые мышь, и CD1 является беспородной, относительно устойчивой линии.
• SAG3 мутанты с делецией показали более выраженные эффекты, чем ΔSAG1 тахизоиты; они были значительно снижены присоединения к клеткам-хозяевам, в пробирке, и смертность была снижена на 80 процентов при инфекции у мышей BALB / с мышей, по сравнению с организмами дикого типа (Dzierszinski и др., 2000).
• Недавно геномный кластер, содержащий четыре брадизоитных конкретных провисает (SAG2c, SAG2d,
SAG2x и SAG2y) был удален в одном нокаута. Удаление этих четырех провисает (ΔSAG2cdxy) дали жизнеспособные тахизоиты, которые могли бы еще различающиеся-entiate в bradyzoites в пробирке. По сравнению,
предварительные исследования в естественных условиях показали, что 9 из 10 ΔSAG2cdxy-инфицированные мыши были отрицательными для кист головного мозга при анализе через 3 месяца после заражения (J. Saeij и J. Boothroyd, личных
связи). Следовательно, из нокаутов SAGΔпоявляется SAG2cdxy наиболее пром-Изинга в качестве кандидата вакцины, потому что, хотя он по-прежнему инфекционный и может превратиться в bradyzoites она сохраняется плохо, если вообще.
• Два секреторной везикулы белка (ROP1 и GRA2) ген-мутанты с делецией также генерироваться. Срыв либо ROP1 или GRA2 в результате каких-либо различий в темпах роста или
хост-клетки в пробирке инвазивность, хотя ΔGRA2 был менее вирулентными у мышей (Сольдати и другие., 1995; Mercier и др., 1998).
• Разрушение BAG1, в брадизоитный конкретного белка теплового шока, считалось, что мешает формированию или жизнеспособности цист ткани. Тем не менее, в одном исследовании (Bohne и др., 1998) разрушение BAG1 не оказывает влияния на формирование ткани цист, в то время как во втором исследовании (Zhang и др., 1999) разрушение BAG1 может только уменьшить количество цист ткани в мышь
мозг примерно в пять раз. В последнем исследовании, летальная доза сΔBAG1 сделал увеличение от 2 × 106 5 × 107, По сравнению с родительским штаммом (PLK клональной линии, полученная из ME49). Тем не менее, цисты тканей все еще формируются, и были совершенно нормальными, доказывая, что BAG1 не является существенной для bradyzoites. Авторы предположили, что BAG1 гомологичные гены могут существовать в токсоплазмы, порождая некоторую избыточность.
Ослабленные паразиты могут также быть получены путем ориентации экспрессии важных генов. Поскольку выброска Тион таких генов сразу приводишь к нежизнеспособным паразитам, ориентированный на экспрессию
| СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ Вакцины для промежуточных хозяевах |
существенные гены должны происходить в условном образом. Для генерации таких условных нокаутных паразитов, индуцируемой системы экспрессии, что обеспечивает жесткое регулирование экспрессии гена будет оптимальным. В идеале, переключение на экспрессии гена-мишени приведет к нормальному фенотипу паразита, тогда как уменьшение экспрессии гена-мишени приведет к ослабленному (летальному) фенотипу. Мы и другие разработали систему экспрессии тетрациклиновой-индуцируемый, чтобы условное выражение основных генов. В Интервете паразитологии, Николь ван Poppel показал, что эффективный транскрипционный контроль
T. гондий с помощью системы экспрессии тетрациклина-индуцируемого может быть получена с использованием YFPtetR, репрессора, состоящий из желтого флуоресцентного белка (YFP), слитые с N-концом дикого типа (репрессор тет тетра). YFPtetR было показано, что функциональная репрессора с мощностью 88-кратного подавления транскрипции при экспрессии в Т. гондий (ван Poppel и др., 2006). Как показано на рисунке 24.1, в отсутствие тетрациклина YFPtetR будет блокировать экспрессию репортера бета-галактозидазы, в то время, когда тетрациклина присутствует YFPtetR будет освобожден из его элементов оператора, освобождая блок на транскрипцию и, таким образом, получая нормальную экспрессию бета- галактозидазы.
YFPtetR был в 10 раз более чувствительным к тетрациклину по сравнению с диким типом тетром, и в результате YFPtetR может регулироваться с низкими нетоксичными концентрациями тетрациклина. Во время этих шпилек-х лет мы уже отмечали, что Т. Gondii промоутеры часто имеют несколько сайтов начала транскрипции, что позволит снизить уровень регулирования с Tet-репрессорами. Таким образом, промотор гена TgRPS13 (кодирующий малой субъединицы рибосом белок 13) был выбран в нашей лаборатории в качестве сильного промотора, содержащего только один основной сайт начала транскрипции, который после интеграции 4 повторных Tet-оператор элементов показал 100-кратное регулирование с YFPtetR, Сегодня это самые высокие индуцируемые уровни экспрессии, достигнутые в Т. гондий. В настоящее время, мы изучаем, насколько это индуцируемая система может регулировать экспрессию эндогенного и существенного рибосомального белок, TgRPS13, путем интеграцией нескольких сайтов Teto в его гене промоторной области. Такие условные летальные паразиты требуют, чтобы они размножают в присутствии тетрациклина. При отсутствии tetracy-Клайн, такие паразиты обедненный TgRPS13 и, как ожидается, чтобы умереть, если концентрация TgRPS13 слишком мала. Такие паразиты являются полезными в качестве инвазивных, но не стойких вакцинных штаммов в животных или человека. Использование условных мутантов как живые вакцины такие паразиты обедненный TgRPS13 и, как ожидается, чтобы умереть, если концентрация TgRPS13 слишком мала. Такие паразиты являются полезными в качестве инвазивных, но не стойких вакцинных штаммов в животных или человека. Использование условных мутантов как живые вакцины такие паразиты обедненный TgRPS13 и, как ожидается, чтобы умереть, если концентрация TgRPS13 слишком мала. Такие паразиты являются полезными в качестве инвазивных, но не стойких вакцинных штаммов в животных или человека. Использование условных мутантов как живые вакцины
YFPTetR
1 4
(1) Экспрессия YFPtetR последовал вероятно димеризации
(2) Связывание YFPtetR к элементам Teto в промоторе и ингибирование экспрессии бета-галактозидазы
(3) Выпуск YFPTetR на связывание тетрациклина с последующим выражением бета-галактозидазы
(4) Истощение тетрациклина вновь создать ингибиторный статус
LacZ
LacZ
РИСУНОК 24,1 Тетрациклин-индуцируемый выражение с YFPtetR в Т. гондий. Схематическая фигура демонстрирует, как геномному интегрированный YFPtetR регулирует Teto-содержащие промоторы в тетрациклину-зависимым образом (см текста для получения более подробной информации).
734 ВАКЦИНАЦИЯ ПРОТИВ ТОКСОПЛАЗМОЗ: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ
требует, чтобы эти паразиты являются безопасными - т.е. инка-pable реверсии к вирулентному фенотипу вследствие мутаций. На данный момент он слишком рано, чтобы сдерживать-шахтное безопасность таких паразитов, но условно-живые штаммы ВИЧ, содержащие тетрациклин-регулируемой транскрипцию, рассматриваются в качестве вакцин для человека, иллюстрирующий, что это может иметь клинический потенциал (Верхоэф и др., 2001),
Soldati и сотрудники произвели подобную систему режет-ленность, но они использовали кодоны адаптированного тетр имени тетрSчтобы получить выражение в Т. гондиях, и использовал производное anhydrotetracyline к чрезмерному приходят токсические эффекты тетрациклина (Мейснер и др., 2001). В их системе, тетрSоказываемое регулирование в 15 раз. В ходе этих исследований они также показали, что слияние тетраSс трансактиватором VP16 был неактивным, вероятно, потому, что VP16 не соединяется с транскрипционным аппаратом токсоплазмы. В последующем исследовании (Мейснера и др., 2002а) искусственный трансактиватором был сгенерирован, где тетрSбыл слит с 26 амино-кислоты длинной гидрофобной последовательности, создавая anhydrotetra-циклин-зависимой трансактиватор (названный Tatì-1) с уровнем 15-20-кратного регулирования. Tatì-1 был использован для регуляции экспрессии миозина А, при помещении под контролем промотора, содержащего
7 повторяющиеся элементы Tet-оператор. Myosin А думал к власти скользят моторику токсоплазмы, тем самым является решающим для рассеивания паразита и / или вторжения. Таким образом, паразиты были получены с миозина А выражение будучи зависимой от Tati-1. В присутствии anhydrotetracycline, Tatì-1 больше не трансактивирует и миозин А выражение было остановлен, что приводит к паразитам, которые не могли скользить и были только 20 процентов инвазивными по сравнению с паразитами дикого типа, но которые могли бы расти с нормальной скоростью, как только внутри гостья. Эти паразиты вводили Balb / C мышей, и были показаны, что несмертельный, когда главным сохранится в присутствии anhydrotetracycline (подаются через питьевую воду). Интересно, что через 11 дней anhydrotetracycline добавка была остановлена, и мыши оставались жизнеспособными и были защищены от обычно летального с 150 RH-деформированных тахизоитами. Же система Tatì-1 недавно была использована, чтобы регулировать экспрессию TgAMA1 (Митали и др., 2005). AMA1 является ведущей вакциной
кандидат в исследовании Plasmodium, и представляет собой секретируемый белок micronemal. Условное Expres-сор из TgAMA1 был сгенерирован, экспрессия которого регулируется с Tati-1. Исследования с этими мутантами показали, что тахизоиты не выражающие TgAMA1 больше не агрессивны и не могут секретировать rhoptries. Нет в естественных условиях исследования не было зарегистрировано с этими мутантами, но можно предусмотреть применение вакцины с этой условной деформацией TgAMA1.
Таким образом, обратный генетические методы позволили создать мутантные штаммы аттенуированных токсоплазмов с потенциалом вакцины. Урацил ауксотрофная мутант, порожденный disrup-ного CPSII является особенно перспективным. Кроме того, условно летальные мутанты паразиты были сгенерированы, которые являются инфекционными и может вызвать защитный иммунный ответ без видимых вредных воздействий на хост. Это будет особенно важно, чтобы продемонстрировать безопасность мутантов до таких генетически модифицированных организмов (ГМО) могут быть проверены и используются в полевых условиях.