Для подавляющего большинства микроорганизмов (гетеротрофов) источниками углерода являются готовые органические вещества, многие их которых одновременно являются и источниками азота (белки, аминокислоты и др.).
К этой, основной по численности группе микроорганизмов относятся и патогенные, у которых гетеротрофность выражена в наибольшей степени.
Общеупотребительными источниками углерода и азота с повышенной питательной ценностью являются различные продукты специальной обработки мяса животных, главным образом, крупного рогатого скота, конины, а также казеина, дрожжевой биомассы, соевых бобов и др.
Основными продуктами, получаемыми из мяса животных и используемыми для изготовления питательных сред являются -- мясная вода, мясной экстракт, ферментативные и кислотные гидролизаты.
Мясную воду (мясной настой, мясной инфуз) получают из фарша, приготовленного из очищенной мышечной ткани. К фаршу добавляют воду в отношении 1: 2 и оставляют при 4 - 10оС на 18 - 24 ч, после чего смесь кипятят в течение 1 часа и фильтруют для отделения фарша.
Для увеличения концентрации мясной воды соотношение мясного фарша и воды можно менять до 1: 1 и меньше, а при последующем изготовлении среды ее соответственно разводят. При использовании мяса низкого качества рекомендуется соотношение 1: 1 и такую мясную воду используют без разведения.
В мясной воде (1: 1) должно содержаться (%, масс): общего азота -- 0,3; аминного -- 0,07; сухих веществ -- 2,4 - 2,8; белка -- 0,45.
Для приготовления широко используемых сред -- МПБ и МПА к мясной воде добавляют пептон и натрия хлорид в концентрациях 1 и 0,5% соответственно.
Мясной экстракт получают, главным образом, при продолжительной варке мясного фарша в автоклаве с последующей выпаркой мясного бульона в вакуум-аппарате до образования пастообразного продукта.
Такой продукт содержит воды 18%, органических веществ -- 61%, минеральных -- 21%.
Мясные экстракты выпускают и в виде сухих порошков, легко растворимых в воде и содержащих в среднем 12% общего азота, 1,1% аминного азота, 15,6% минеральных веществ.
При приготовлении питательных сред мясную воду часто заменяют мясным экстрактом несмотря на то, что они отличаются не только технологиями их получения, но и составом; при получении экстракта теряются термолабильные вещества, содержащиеся в мясной воде.
Пептоны
Важнейшим компонентом многих питательных сред являются пептоны -- продукты ферментативного гидролиза белков мяса.
В микробиологической практике в основном применяются пептоны, получаемые с помощью пепсина, панкреатина, трипсина, используемых как в виде частично очищенных, так и «сырых» препаратов. К числу «сырых» препаратов относятся измельченные ткани желудков свиней и поджелудочных желез свиней и рогатого скота.
Под действием указанных ферментов образуются пептоны, полипептиды различной степени сложности и свободные аминокислоты, однако, следует учитывать, что пептоны, получаемые с использованием препаратов, содержащих пепсин и препаратов, содержащих панкреатин, различаются по глубине гидролиза белков.
Известно много способов получения пептонов, как пепсинного, так и панкреатического, используемых для культивирования отдельных видов микроорганизмов, с учетом их специфических особенностей.
Пептоны выпускают, главным образом, в сухом виде -- в виде желто-бежевого порошка.
Пептоны характеризуются высокой питательной ценностью для микроорганизмов, но одновременно и значительным недостатком, а именно -- нестандартностью. Повышенная вариабельность пептонов по составу и питательной ценности обуславливается не только нестандартностью исходного сырья -- мяса, но нестандартностью источников ферментов -- желудков, поджелудочных желез, получаемых от разных животных, хранящихся в разных условиях и т.д.
Рыбные продукты с успехом используются для получения высокопитательных сред для микроорганизмов, так как по химическому составу мясо животных практически не отличается от мяса рыб.
В нашей стране выпускаются в сухом виде и широко применяются в микробиологической практике общеупотребительные среды на основе панкреатического гидролизата кильки -- питательный бульон (СПБ) и питательный агар (СПА).
Казеин -- фосфорсодержащий белок, получаемый из обезжиренного молока и являющийся наиболее полноценным видом сырья для питательны сред. От других источников белка отличается постоянством состава, содержит все аминокислоты и некоторые витамины.
Панкреатический гидролизат казеина (триптический гидролизат, панкреатический перевар, триптический пептон, панкреатический пептон казеина) получают с использованием ферментов поджелудочной железы, пептический -- с использованием пепсина.
Ферментативные гидролизаты казеина содержат низкомолекулярные пептиды, аминокислоты, в том числе и триптофан, соотношение которых в составе гидролизатов варьирует в зависимости от способа их получения.
В настоящее время известно много способов и их различных модификаций для получения таких гидролизатов.
Кислотные гидролзаты казеина получают использованием высоких температур (110оС и выше) и крепкой соляной кислоты, при этом достигается почти полный его гидролиз до аминокислот. Однако при этом разрушаются углеводы, триптофан, цистин и частично треонин и серин, а содержание натрия хлорида увеличивается до 38 - 40%.
Питательные среды на основе различных гидролизатов казеина используются в диагностике инфекционных заболеваний.
В качестве источника углерода, азота и других компонентов для многих общеупотребительных и специальных питательных сред используются продукты, получаемые из дрожжей: дрожжевая вода, дрожжевой настой, дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, кислотные и ферментативные гидролизаты дрожжей.
Дрожжи содержат до 53% белка, 25 - 40% углеводов и являются богатым источником витаминов группы В, витамина Д, и других факторов роста -- пуриновых и пиримидиновых оснований. Белок дрожжей сбалансирован по аминокислотному составу и по этому показателю близок к животному белку.
Дрожжевой автолизат. Дрожжевые клетки содержат значительное количество различных протеолитических ферметов (пепсиназа, триптаза, эритаза и др.), под действием которых в определенных условиях происходит автолиз клеток и высвобождение из них белков в виде пептонов, альбумоз, а также аминокислот, нуклеиновых кислот и др. Эти компоненты и определяют состав автолизата, который сопоставим с триптическим гидролизатом других белков, в том числе и по содержанию аминного азота. Содержание аминного азота дрожжевого автолизата достигает 1000 - 1200 мг%.
Дрожжевые экстракты представляют собой водные экстракты из дрожжей, которые предварительно гидролизуют или подвергают автолизу.
Гидролизаты дрожжей получают с помощью ферментов или кислот. Ферментативные гидролизаты получают с использованием поджелудочной железы или панкреатина, кислотные -- с использованием фосфорной или соляной кислот.
По основному химическому составу, а именно содержанию общего и аминного азота, пептонов, триптофана, дрожжевые гидролизаты сходны с мясными гидролизатами, к тому же пептонов в дрожжевых гидролизатах больше, чем в мясных.
На бульонах из гидролизатов дрожжей хорошо проявляется рост энтеробактерий, кокков и коринебактерий.
В качестве основ для питательных сред используют продукты, получаемые из растительного сырья и, прежде всего, из бобов сои, богатых белком, витаминами, минеральными веществами. Из значительного числа таких продуктов преимущественное использование в практике изготовления питательных сред нашли ферментативные и кислотные гидролизаты сои (пептоны). Ферментативный гидролиз осуществляют с использованием пепсина, папаина, панкреатина, а кислотный -- соляной кислоты.
Таким образом, все вышеуказанные продукты обработки мяса животных, рыбы, казеина, дрожжей, растительного сырья представляют собой органические источники углерода и азота. Однако для многих микроорганизмов легкоусвояемым источником азота является аминный азот различных неорганических солей аммония.
2.2 Основные принципы изготовления питательных сред
Для микробиологических исследований выпускают среды двух типов -- готовые к употреблению и сухие среды. И те и другие среды имеют недостатки и преимущества, а в целом выгодно дополняют друг друга.
Готовые питательные среды
Для получения качественных, стабильных по составу питательных сред необходимо соблюдать в процессе их изготовления определенные условия.
Среды должны изготовляться в точном соответствии с их рецептурой (качественно-количественном составом). При этом необходимо соблюдать и последовательность внесения компонентов, указанную в инструкции по их изготовлению. Отклонение от этого правила может привести к помутнению среды, образованию осадка.
Последовательное растворение компонентов в дистиллированной или водопроводной воде проводят при нагревании и постоянном перемешивании, осуществляя визуальный контроль за полнотой их растворения. Необходимо следить за тем, чтобы продолжительность нагрева среды была бы минимальной, так как в результате длительного воздействия повышенных температур возможны деструкция и изменение свойств отдельных компонентов.
Особого внимания требует коррекция рН среды на всех стадиях ее изготовления.
Коррекцию рН следует вести осторожно с тем, чтобы не допустить существенного подкисления или перещелачивания среды, и таким образом избежать необходимости последующей дополнительной коррекции. Дополнительное внесение кислот и щелочей не только влияет на химические процессы, протекающие в среде, но и увеличивает концентрацию минеральных солей.
Кроме того, необходимо учитывать, что в процессе стерилизации сред автоклавированием этот показатель, в зависимости от состава среды, может изменяться в той или иной степени. В этом случае вводится соответствующая поправка к уровню рН, устанавливаемому в среде до стерилизации с тем, чтобы в готовой стерильной среде он соответствовал бы требуемому значению.
После стерилизации рН проверяют вновь.
Некоторые компоненты среды следует стерилизовать отдельно из-за их чувствительности к нагреванию или к действию рН при повышенной температуре. Так, например, в средах с повышенным уровнем рН (около 8,0) и содержащих глюкозу поле стерилизации рН снижается до 5,0 - 6,0, при этом глюкоза карамелизуется, среда приобретает темную окраску.
Для таких сред глюкозу стерилизуют отдельно при рН 5,0 - 6,0 и вносят в стерильную среду перед посевом.
В подавляющем большинстве питательные среды должны быть прозрачными. С этой целью их подвергают фильтрованию. Жидкие и содержащие желатин среды (в горячем виде) фильтруют через бумажные фильтры, среды с агаром -- через ватно-марлевые.
В случаях, когда после фильтрования среды остаются мутными, к среде добавляют вещества-осветители: белок куриного яйца, сыворотку крови лошади или других животных, цельную кровь, химически чистый мел, древесный уголь и др.
Для изготовления питательных сред в больших объемах желательно использовать емкости из нержавеющей стали или боросиликатного стекла. Для этих целей абсолютно непригодна медная, оловянная и оцинкованная посуда как источник ионов тяжелых металлов, обладающих ингибиторными свойствами.
Приготовленные среды разливают в чистую и сухую посуда (колбы, флаконы, пробирки, специальные планшеты и др.), которую закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют.
Однако в таком виде стерильная среда не может длительно храниться, так как быстро сохнет. Чтобы избежать высыхания среды разливают в стеклянные флаконы, герметично закрывают их резиновыми пробками, которые затем завальцовывают алюминиевыми колпачками. В таком виде среды могут храниться больше года.
Среды, разлитые в чашки Петри, также можно длительно хранить, если чашки со средой запаять в полиэтиленовые пакеты.
Готовые к употреблению питательные среды широко используются в мировой практике благодаря ряду их преимуществ перед сухими средами.
Сухие питательные среды
Сухие питательные среды и обезвоженные компоненты для их изготовления выпускают различные предприятия и фирмы.
Сухие среды выпускают, главным образом, в виде мелкодисперсных порошков, но могут быть представлены и в виде гранул, шариков, таблеток и в другой форме. Они хорошо растворяются в воде, не вызывая помутнения или образования осадка. Они, как правило, имеют большой срок реализации при строгом соблюдении условий хранения.
Преимуществом сухих питательных сред является простота изготовления из них сред, готовых к употреблению. С этой целью навеску среды, указанную на этикетке, вносят в соответствующий объем дистиллированной или водопроводной воды, растворяют при нагревании до кипения и далее поступают так, как при изготовлении среды из отдельных компонентов (сред, готовых к употреблению).
Одной из основных причин, по которой из сухих сред могут быть получены некачественные готовые среды, являются ошибки потребителя в процессе использования сухих сред, а именно -- при взвешивании, регулировании рН, стерилизации и др.
Для получения сухих сред используют такое же сырье, как и для сред, готовых к употреблению -- мясо, рыбу, молоко, пептоны, гидролизаты, кровь и др., однако в целях повышения экономичности укрупненного производства часто используют более дешевое сырье невысокого качества.
Все сухие среды гигроскопичны и требуют постоянной защиты от влажного воздуха, так как увлажнение приводит к снижению их качества, к порче.
При работе с сухими питательными средами следует учитывать, что при ингаляции их (прежде всего порошков) или при продолжительном контакте с кожей могут возникнуть аллергические реакции.
Сухие питательные среды в очень широком ассортименте выпускают многие зарубежные фирмы: Becton Dickinson (США), «Oксоид» (Великобритания), Bio-Rad (Франция), «Иммуна» (Чехословакия) и многие другие. Однако при этом не исключается возможность того, что среды под одним наименованием, выпускаемые разными фирмами, дают разные результаты.
В нашей стране ассортимент сухих питательных сред не достаточно широк и в настоящее время потребность микробиологии во многих средах удовлетворяется за счет готовых к употреблению сред. В первую очередь это относится к средам сложным по составу, содержащим редкие или дорогостоящие ингредиенты и предназначенные для особо требовательных микроорганизмов, а также к средам для грибов и актиномицетов.
Глава 3. Качественное преимущество промышленных питательных сред
ООО «ЦФГС» - Центральная фабрика готовых сред - это первое в России инновационное предприятие по промышленному производству качественных готовых микробиологических сред, соответствующее международным стандартам.
3.1 Значение промышленного производства сред
Из лаборатории в промышленное производство: готовые питательные среды - это сложные многокомпонентные, стандартные по составу и физико-химическим свойствам, расфасованные по емкостям субстраты для культивирования микроорганизмов, готовые к употреблению - то есть не требующие трудоемкого и экономически затратного приготовления внутри лаборатории, розлива, а также стерилизации силами лабораторного персонала. Приготовление сред - это трудоемкий процесс, состоящий из множества этапов и «подводных камней». Использование готовых сред позволяет избежать сложного и длительного этапа по изготовлению сред в каждой конкретной лаборатории (подбор ингредиентов, точное соблюдение рецептуры, последовательности внесения компонентов, коррекция pH среды, стерилизация всех компонентов, фильтрация). Неизменное качество: Промышленно изготовленные питательные среды стабильны по составу. При этом контроль качества сред производится самим предприятием, снимая с лабораторного персонала ответственность за соблюдение всех необходимых параметров среды (в отличие от ручного способа приготовления).
Гибкость: Производство готовых сред на территории России - это еще и отсутствие необходимости длительной транспортировки, а значит возможность регулярных бесперебойных поставок, увеличение остаточного срока годности и возможность включения в состав сред уникальных чувствительных компонентов.
Разнообразие: Производимые промышленным образом среды могут иметь любую рецептуру, включая индивидуальную, или такую, которая из-за своей сложности исключает возможность приготовления данной среды из сухого полуфабриката. Будущее за стандартизацией: Стандартизация и организация процессов планирования, производства и контроля на предприятии, в том числе автоматизированного контроля обеспечивает воспроизводимый уровень качества продукции, а значит, возможность использовать готовые среды в контроле качества на других предприятиях, а также, наконец, приблизиться к решению вопросов стандартизации клинических лабораторных исследований. Ведение эталонных культур, количественный биологический контроль сред, контроль физико-химических параметров и прочие этапы контроля качества - все это становится каждодневной задачей производителя, а не лаборатории.
Производство / Технологии
Производство готовых сред организовано в соответствии с зарубежными стандартами на основе зарубежной технологии разработанной компанией Novamed (Израиль). Современное производство готовых питательных сред расположено в здании общей площадью около 530 м2 и оснащено современным технологическим и аналитическим оборудованием, которое специально разработано и изготовлено для промышленного приготовления и розлива сред. На производстве задействован высококвалифицированный научный и рабочий персонал.
Производственные процессы происходят в специально оборудованных чистых помещениях. Организация чистых помещений и работы в них персонала осуществляется строго в соответствии с ГОСТ Р ИСО 14644-1-2002 «Чистые помещения и связанные с ними контролируемые среды». Технологии производства из сухих смесей и других компонентов обеспечивают максимальную защиту от контаминации готовой продукции. Процесс приготовления и розлива среды полностью автоматизирован. В специализированных автоматах для варки сред сухой порошок и др. компоненты смешиваются с водой, прошедшей многостадийную специальную очистку. Смесь проходит этап стерилизации при соответствующем режиме и подается в устройство для розлива среды в чашки Петри (флаконы, пробирки). Розлив происходит в специальной чистой зоне.
Все производственные этапы осуществляются в строгом соответствии с утвержденными техническими условиями, производственными регламентами и рабочими инструкциями, что обеспечивает абсолютную прослеживаемость производственного процесса, воспроизводимость и стандартность рабочих процедур.
3.3 Многостадийный контроль качества
Согласно ГОСТ ISO 9001-2011 постоянный строгий контроль качества осуществляется на каждом этапе производства: - Подготовка воды очищенной - Производственная среда (мониторинг) - Приемка сырья и материалов - Приготовление среды - Розлив среды - Конечный продукт - Упаковка и маркировка На предприятии предусмотрен как производственный, так и лабораторный контроль, что позволяет гарантировать высокое качество готового продукта, поставляемого в отечественные лаборатории.
3.4 Документы
Все питательные среды зарегистрированы в МЗ РФ.
Каждая серия и наименование сопровождаются паспортом качества и подробной инструкцией по применению на русском языке.
Используемые стандарты: - ГОСТ Р ИСО 14644-1-2002 «Чистые помещения и связанные с ними контролируемые среды» - ГОСТ ISO 9001-2011 - M22-A3 Vol. 24 No. 19 Replaces M22-A2 Vol. 16 No. 16 Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard-Third Edition
питательный качество культивирование микроорганизм
Заключение
Качество питательных сред зависит, от таких, казалось бы, «частных» моментов, как хранение, стерилизация, лабораторное приготовление и проверка питательных сред, что служит залогом информативности важнейшего для клиники аналитического этапа исследования микроорганизмов.
В этой курсовой работе сделана попытка дать ответ на ряд вопросов: на основе анализа литературы выявить особенности состава различных питательных сред, выявить приготовление различных питательных сред, доказать качественное преимущество промышленных питательных сред.
Что касается вопроса состава питательных сред, то следует обратить внимание на то, что питательные среды должны содержать все элементы, необходимые для их роста, в определенных концентрациях, определенной химической форме и в том количественном соотношении, в каком они находятся в клетках. Основной качественно-количественный состав питательных сред, как правило, и определяется с учетом химического состава микробной биомассы, который в общих чертах одинаков у всех организмов.
Различие в приготовлении питательных сред состоит в следующем. Для микробиологических исследований выпускают среды двух типов -- готовые к употреблению и сухие среды. И те и другие среды имеют недостатки и преимущества, а в целом выгодно дополняют друг друга. Готовые к употреблению среды должны изготовляться в точном соответствии с их рецептурой (качественно-количественном составом). При этом необходимо соблюдать и последовательность внесения компонентов, указанную в инструкции по их изготовлению. Отклонение от этого правила может привести к помутнению среды, образованию осадка. Преимуществом сухих питательных промышленных сред является простота изготовления из них сред, готовых к употреблению. С этой целью навеску среды, указанную на этикетке, вносят в соответствующий объем дистиллированной или водопроводной воды, растворяют при нагревании до кипения и далее поступают так, как при изготовлении среды из отдельных компонентов (сред, готовых к употреблению). Одной из основных причин, по которой из сухих сред могут быть получены некачественные готовые среды, являются ошибки потребителя в процессе использования сухих сред, а именно -- при взвешивании, регулировании рН, стерилизации и др.
Промышленно произведённые питательные среды - это сложные многокомпонентные, стандартные по составу и физико-химическим свойствам, расфасованные по емкостям субстраты для культивирования микроорганизмов, готовые к употреблению - то есть не требующие трудоемкого и экономически затратного приготовления внутри лаборатории, розлива, а также стерилизации силами лабораторного персонала. Приготовление сред - это трудоемкий процесс, состоящий из множества этапов и «подводных камней». Использование готовых сред позволяет избежать сложного и длительного этапа по изготовлению сред в каждой конкретной лаборатории (подбор ингредиентов, точное соблюдение рецептуры, последовательности внесения компонентов, коррекция pH среды).
Список использованных источников
1. Бактериологический контроль питательных сред. Методические рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемиологических станций и больниц. - Хабаровск: МЗ РСФСР, 1979.
. Герхард Ф.(ред). Методы общей микробиологии. М., 1984, тт.1 - 3.
. ISO/TS 11133-2:2003. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководство по подготовке и приготовлению культуральных сред. Часть 2. Практическое руководство по тестированию эффективности культуральных сред.
. МУК 4.2.2316-08 Методы контроля бактериологических питательных сред: Методические указания. -М: ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора, 2008, 67 с.
.Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие/Под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной.-М.:Медицина, 2004.-576 с.
. ISO 8199: 1988 "Общее руководство по определению количества микроорганизмов с помощью питательной среды".