Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
| № | Шаги проведения |
| ПЦР – это молекулярно – биологический метод диагностики. | |
| Суть ПЦР состоит в циклическом удвоении определенного участка ДНК с помощью специфических праймеров (затравок) особых ферментов – полимераз. | |
| В результате увеличения ДНК образуется достаточное ее количество, чтобы можно было выявить физико-химическими методами хроматографией или электрофорезом. | |
| Праймеры получают из известных геномов возбудителей. | |
| Обязательным условием проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности объекта исследования (бактерии, вирусов и т.д.) | |
| Исследуемую ДНК собирают в пробирке вместе с необходимыми компонентами и прогревают | |
| При этом комлементарные нити ДНК разъединяются. Этот этап называется денатурацией ДНК. | |
| К образовавшимся одноцепочечным ДНК присоединяют праймеры. Этот этап называется «отжигом» (присоединением) | |
| Фермент полимераза достраивает комплементарные цепи ДНК. Этот этап называется «элонгация» (удлинение). | |
| Как правило, проводится 30 циклов, что позволяет получить 2і° копий участка ДНК возбудителя. | |
| ИТОГО: |
РИФ прямая
| № | Шаги проведения |
| При прямом методе готовится препарат, содержащий исследуемые микроорганизмы (АГ). | |
| Фиксируют его жидким фиксатором (ацетоном). | |
| Обрабатывают специфической люминесцирующей сывороткой (ацетон). | |
| Отмывают избыток сыворотки. | |
| Высушивают препарат и рассматривают в люминесцентном микроскопе. | |
| При положительной реакции наблюдаются свечение антигена. | |
| Это реакция позволяет за 1-2 часа обнаружить микробные антигены. | |
| Метод прост и высокоспецифичен, но требует большого набора различных люминесцирующих сывороток. | |
| ИТОГО: |
Иммуноферментный анализ (ИФА)
| № | Шаги проведения |
| Специфицеский антиген адсорбируют в лунках полистиролового планшета. | |
| Инкубируют с испытуемыми сыворотками человека. | |
| Отмывают несвязавшиеся иммуноглобулины. | |
| Связавшиеся иммуноглобулины выявляют с помощью антиглобулиновой сыворотки, к которой прикреплен фермент пероксидаза. | |
| Добавляется субстрат (пероксид водорода) и индикатор (диамин бензидин), которые позволяют оценить ферментативную активность по интенсивности окраски. | |
| Интенсивнось окраски можно оценить визуально или с помощью спектрофотометра. | |
| Интенсивность окраски пропорциональна сорбированных на антигене антител. | |
| ИФА позволяет выявить антитела к разным антигенам. | |
| ИТОГО: |
Цветная проба для определения типа вируса полиомиелита
| № | Шаги проведения |
| Цветная реакция основана на том, что клеток культуры ткани при своем росте изменяет РН питательной среды за счет выделения или кислых продуктов метаболизма. Это определяется по изменению цвета индикатора фенолового красного, входящего в состав среды. В кислой среде феноловый изменяет свой цвет в желтый. При поражении клеток вирусом цвет среды красный. | |
| В 3 пробирки вносят по 0,25 мл вируссодержащий материал, по 0,4 мл вазелинового масла, чтобы не было воздуха кислорода, по 0,25 мл типовой сыворотки вируса полиомиелита (1, 2, 3) в соответствующие пробирки. На 1 час оставляют при комнатной температуре. | |
| Через 1 час во все пробирки добавляют по 0,25 мл клеточной суспензии. | |
| Учет результатов. Через 48-72 час читают результат. |
РТГА для определения типа вируса гриппа
| № | Шаги проведения |
| Реакция применяется для определения типа вируса. | |
| В 5 луночек пластмассового планшета вносят по 0,25 мл вируссодержащий материал, добавляют типовые сыворотки против вируса гриппа – по 0,25 мл. А0; А1; А2; В; С. Затем – по 0,5 мл 1% куриных эритроцитов, планшет оставляют при комнатной температуре на 1 час. | |
| Через 1 часа читают результат реакции. | |
| Вирус гриппа относится к тому типу, с которым образовался осадок в виде «пуговки». | |
| Прокомментируйте полученный результат. | |
| ИТОГО: |
РГА
| № | Шаги проведения |
| Агглютинация эритроцитов происходит в присутствии вируса, которые адсорбируются на эритроцитах. | |
| РГА ставят на специальных пластмассовых планшетах с лунками. | |
| В луночках готовят разведения вируса от 1:10 до 1:320-я луночка контроль эритроцитов. Во все луночки вносят по 0,5 мл взвеси куриных эритроцитов. Планшет оставляют при комнатной температуре. | |
| Результат реакции читается через 30 мин. В контрольной луночке отмечается осадок эритроцитов в виде «пуговки», в случае положительной реакции на дне луночек образуется осадок в виде зонтика. | |
| Прокомментируйте полученный результат | |
| ИТОГО: |
Определение токсигенности дифтерийных бактерии
| № | Шаги проведения |
| Токсигенные бактерии – это те же бактерии, которые выделяют экзотоксин. Для определения токсигенности применяют метод диффузии в агар. | |
| На середину с питательным агаром кладут фильтровальную бумагу, заранее смоченную антитоксической противодифтерийной сывороткой. | |
| С 2-х сторон от бумаги делают посев культур, выделенных от больных. | |
| Чашки помещают в термостат при t0 – 370С на 24 часа. | |
| Через сутки учитывают результата: линии преципитации (или «усики») образуются в местах взаимодействия экзотоксина с антитоксином. Происходит реакция нейтрализации токсина антитоксином. | |
| ИТОГО: |
РСК
| № | Шаги проведения |
| Реакция основана на взаимодействи иммунной сыворотки со специфическим антигеном, при наличии комплемента. Образующиися комплекс антиген+ антитело связывает комплемент. | |
| В случае отсутствия комплекса антиген+антитело комплемент остается свободным. | |
| Процесс связывания комплемента с комплексом невидимый. | |
| Для того чтобы установить, произошло связывание комплемента или нет, вводится вторая (гемолитическая) система, состоящая из гемолитической сыворотки и эритроцитов барана. | |
| При наличии свободного комплемента наступает гемолиз. | |
| РСК проводится в 2 этапа: I-этап. Взаимодействие антигена и антитела, связывания комплемента (в 1-й пробирке), (во 2-й и 3-й пробирках) связывания не происходит т.к. они являются контрольными, в них нет одного из ингредиентов (или антигена, или антитела). II-этап. Добавление гемолитической системы для определения в каком состоянии находится комплемент (в связанном или свободном). | |
| В случае положительного результата на опытной пробирке не произойдет гемолиз ввиду отсутствия свободного комплемента. В контрольных пробирках произойдет гемолиз т.к. в присутствии свободного комплемента гемолитическая сыворотка гемолизирует эритроциты барана. | |
| В случае отрицательного результата во всех 3-х пробирках – гемолиз. | |
| Прокомментируйте полученный результат. | |
| ИТОГО: |