Реферат
Проверила:
Доцент
Торопова Галина Валерьевна
Выполнил:
Студент 2 курса, гр. 216
Лобзин В.А.
Красноярск
Оглавление
Введение. 3
Кратко о микропрепаратах. 4
Выявление неклеточных структур соединительной ткани. 7
Окраска по Ван Гизону. 7
Окраска по методу Маллори. 8
Импрегнация серебром.. 9
Окраска орсеином по методу Унны — Тенцера. 10
Метод окраски Шморля. 11
Окраска клеточных структур. 12
Окрашивание мазков по Романовскому. 12
Заключение. 14
Введение
Микропрепараты несут на себе важнейшую роль в различных научных исследованиях и выступают в качестве одного из орудия для врача. Действительно, без них было бы невозможно узнать многие паталогические процессы, происходящие в той или иной ткани и разработать методы лечения, воздействия на пораженные участки. Поэтому так важно, чтобы микропрепарат был максимально качественным, т.е. прошел все этапы приготовления, наиболее важным из которых в практическом значении является окраска.
Итак, мой реферат посвящен методам окраски микропрепаратов соединительной ткани.
Кратко о микропрепаратах
По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов:
· срезы органов (толщиной 5-15 нм) – используются чаще всего
· мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки),
· плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты
Приготовление препарата обычно включает 4 следующих этапа:
o Взятие и фиксация материала:
Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) - обычно на 24 ч., для предупреждения процессов самопереваривания тканей, путём денатурации белков. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.
o Обезвоживание и уплотнение материала:
Затем образцы уплотняют парафином или целлоидином - чтобы в последующем их можно было резать на микротоме. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань). Для этого их “проводят” по батарее спиртов - 70 %, 80 %, 96 %, 100 % этанол - по 24 часа в каждом спирте. Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле. Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56 о С. Дают парафину, остывая, затвердеть, вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике, который далее вставляют в специальный прибор - микротом, - служащий для приготовления срезов.
o Приготовление срезов:
С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние. А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа заданной толщины. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем - на предметное стекло.
o Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду:
Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей: ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин). Для окрашивания предметные стёкла со срезами помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой. Препарат опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией), а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.
Особенность окрашивания заключается в том, что оно сводится к контрастированию срезов с помощью солей тяжёлых металлов (свинца, вольфрама, урана). Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны. Поэтому соответствующие места клетки выглядят более тёмными.
Существует множество методов окраски микропрепаратов. Данный спектр объясняется более лучшей окраской определенным красителем какой-либо структуры микропрепарата. Таким образом, многообразие базируется на типе красителя:
| Тип красителя | Пример | Что окрашивает |
| Кислый | Эозин, кислый фуксин | Белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры |
| Основный | Гематоксилин, азур2, кармин | Структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами(ядра, рибосомы, аморфный компонент межклеточного вещества |
| Нейтральный | Смесь кислых и основных красителей. Азур2 + эозин | Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином; Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2 |
| Индифферентный | Судан 3, судан 4 | Суданом окрашиваются жировые капли |
Так и при окраске соединительной ткани выделяют множество методов, которые можно подразделить на две группы:
ü Направленные на выявление внеклеточных структур
ü Окраска клеточных структур
Соединительная ткань составляет более 50 % массы тела, образуя опорный каркас (кости, хрящ и сухожилия) и наружные покровы (кожа), являясь составной частью всех органов и тканей (строма, сосуды, клетчатка). Она состоит из клеточных элементов и межклеточного матрикса, который в свою очередь включает волокна (коллагеновые, ретикулярные, эластические), протеогликаны и гликопротеины. Различают рыхлую неоформленную и плотную оформленную соединительную ткань. В условиях патологии образуются грануляционная и фибрознорубцовая ткань, костная мозоль, гиалин, фибриноид. Все эти виды различаются лишь количественным соотношением основных компонентов и их архитектоникой.
Клеточные элементы соединительной ткани (фибробласты, макрофаги, лимфоциты) окрашивают с помощью общепринятых методов, для характеристики их функционального состояния применяют различные гистохимические методы. Коллагеновые волокна по обьему и массе составляют основную часть межклеточного матрикса, поэтому определяют главным образом тинкториальные особенности соединительной ткани. Эти волокна представляют собой многокомпонентную структуру, состоящую из белка коллагена (точнее коллагенов разных типов), трехспиральные молекулы которого, соединяясь между собой, образуют коллагеновые фибриллы, характеризующиеся поперечной исчерченностью. Фибриллы с помощью межфибриллярного цементирующего вещества, содержащего протеогликаны и гликопротеины, формируют волокна и пучки волокон, тинкториальные свойства которых определяются их сложным химическим составом и микроструктурой.
В настоящее время выделено 14 типов коллагеновых белков, различающихся молекулярной и надмолекулярной структурой.
Большинство этих типов коллагенов можно выявить в ткани с помощью иммуноморфологических методов с моноклональными и поликлональными антителами и к коллагенам соответствующих типов. Гистологические окраски позволяют выявить раздельно коллагеновые и ретикулиновые волокна, однако достоверных способов окраски разных типов коллагена пока не существует.
Мышечную ткань (гладкие и поперечнополосатые мьппцы) обычно выявляют при использовании тех же красочных методов, что и соединительную ткань. С этой целью применяют двух- и трехцветные методы, при которых контрастно окрашиваются коллагеновые волокна и мышцы.
Выявление неклеточных структур соединительной ткани
Окраска по Ван Гизону
Красителем служит смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты, причем первый компонент окрашивает коллагеновые волокна в ярко-красный цвет, а второй придает прочим структурам ткани жёлтую окраску. Окраска разработана американским психоневрологом и патологом Айрой Ван Гизоном в 1889 году.