Ингибиторы протеазы ВИЧ, мутации, вирусная нагрузка
Дэвид Расник, Доктор Философии
ООН
Июль 1997
ВВЕДЕНИЕ
Одной из основных функций ДНК является предоставление инструкций по производству белков. Белки настолько универсальны, что являются основными структурными элементами всех живых существ, включая вирусы. За исключением нескольких специфических РНК, все ферменты являются белками. Энзимы биологические молекулы которые получают вещи сделанные путем действовать на других вызванных молекулах субстратами.
Одним из крупнейших классов ферментов являются протеазы. На поверхности, протеазы выполняют одну из самых простых биологических реакций: они закрепляют протеины в более малые протеины или пептиды. Пептиды - это просто короткие кусочки белков. Точка, в которой пептид поднимается до экзальтированного состояния белка, является произвольной. Протеазы, которые расщепляют прежде всего белки, называют протеиназами, тогда как протеазы, которые расщепляют прежде всего пептиды, называют пептидазами. Для наших целей протеазу ВИЧ можно правильно назвать протеиназой, поскольку ее первичным субстратом является полипротеин Gag-Pol, кодируемый ДНК ВИЧ-провируса.
20 или около того аминокислот связаны друг с другом через амидные связи, чтобы сделать все белки и пептиды, которые существуют. Амидные связи белков получили специальное название пептидных связей, означающее, что они принадлежат белкам и пептидам. Связи пептида очень сильные химические связи и трудны для того чтобы сломать. Тем не менее, при правильных условиях протеазы могут легко разрывать пептидные связи. Каждый день примером является очень активная цистеиновая протеаза под названием химопапаин, которая происходит из растения папайи и является активным ингредиентом в мясе тендеризатора. Chymopapain ломает скрепления пептида мяса прежде чем оно сварено. Пепсин аспартилпротеазы в желудке и сериновые протеазы химотрипсин и трипсин в тонком кишечнике переваривают белки, которые вы едите. Оказывается, протеазы гораздо более сложны и интересны, чем предполагает эта простая картина. Подавляющее большинство протеаз участвует в переработке и регуляции других белков, включая другие ферменты.
Протеазы-это глобулярные белки с углублением или полостью, называемой активным центром. Субстраты помещаются в активный сайт протеазы, где фермент каталитически разрушает специфические пептидные связи, подлежащие расщеплению. Большое количество белков действуют как специфические ингибиторы протеаз, регулируя их активность. Есть также много десятков тысяч маленьких синтетических ингибиторов, разработанных в лабораториях по всему миру, чтобы плотно придерживаться активных мест многих различных протеаз. Синтетические иы АБС битор использованы наиболее часто как инструменты исследования и изредка как потенциальные терапевтические агенты.
Протеазы были разделены в 4 главным образом типа согласно активным характеристикам места которые Общие к каждой группе: Серин, цистеин, аспартил, и metallo. Эти обозначения не имеют ничего общего с субстратами, которые расщепляют протеазы. Протеаза ВИЧ принадлежит к семейству аспартил протеаз. Примерами аспартилпротеаз человека являются пепсин (пищеварительный фермент в желудке), катепсин D (находится в лизосомах внутри клеток) и ренин (одна из протеаз, которая регулирует кровяное давление).
ПРОТЕАЗА ВИЧ
Все, что известно о ВИЧ, было построено из экспериментов in vitro. Важно признать, что все опубликованные заявления о наличии и активности ВИЧ являются экстраполяциями исследований in vitro и не наблюдались непосредственно у людей.
ВИЧ, как и все ретровирусы, содержит гены, кодирующие структурные белки, обволакивающие белки и ферменты. Во время перевода индивидуальные протеины все вставлены совместно сквозной через скрепления пептида для того чтобы сформировать полипротеин Gag-Pol. Похоже, что белки оболочки отделены от полипротеина протеазой хозяина, а не протеазой ВИЧ. Вирусные структурные белки (кодируемые областью gag Гена) и вирусные ферменты (включая ВИЧ-протеазу, кодируемую областью pol гена) связаны пептидными связями, которые должны быть обработаны (расщеплены) ВИЧ-протеазой.
Протеаза ВИЧ не закрепляет каждое скрепление пептида в видимости; она очень определенна о местах расщепления. Из сотен возможностей существует только восемь специфических пептидных связей полипротеина Gag-Pol, которые протеаза ВИЧ должна расщеплять, чтобы вирус реплицировался и созревал должным образом в инфекционные частицы (1).
Производство инфекционных частиц ВИЧ зависит от правильной сборки структурных белков в ядро частицы. Начальные шаги в агрегате включают ассоциацию протеинов прекурсора Gag и Gag-Pol с внутренней стороной мембраны зараженной клетки, следовать взаимодействием прекурсоров друг с другом. Мембранная ассоциация белков-предшественников предшествует расщеплению предшественников протеазой ВИЧ. Протеаза ВИЧ является частью более крупного полипротеина Gag-Pol и функционирует только как димер. Это расположение позволяет протеинам прекурсора приехать на мембрану в координированном образе и в большинстве успешно в предотвращать преждевременную активацию протеазы ВИЧ. После связывания с мембраной протеаза ВИЧ расщепляет отдельные белки-предшественники упорядоченным последовательным образом (2-6). Если все идет хорошо, то пускать почки и отпуск возмужалой, заразной частицы вируса происходят, водящ к новому циклу инфекции и вирусной репликации.
Нарушение протеолитической обработки белков-предшественников ВИЧ является отличной стратегией для блокирования производства инфекционного вируса. Неполная обработка предшественников протеазой ВИЧ все еще приводит к почкованию, но продуцируемая вирусная частица не является инфекционной. Именно поэтому в присутствии ингибитора инфицированные клетки все еще способны продуцировать вирусные частицы, но продуцируемый вирус является дефектным и неинфекционным (2,7). Главный вопрос заключается в том, принесет ли ингибирование ВИЧ терапевтическую пользу?
МУТАНТЫ, УСТОЙЧИВЫЕ К ИНГИБИТОРАМ: МИРАЖ
Многочисленные эксперименты in vitro продемонстрировали, что нарушение протеолитической активности, обусловленное либо присутствием ингибиторов протеазы (2,7-9), либо вредными мутациями протеазы ВИЧ (10-15), приводит к неинфекционным частицам ВИЧ. В результате этих исследований и нескольких клинических испытаний на людях (16-19), ряд ингибиторов протеазы ВИЧ были недавно одобрены для клинического использования. Разочаровывающая клиническая эффективность этих ингибиторов во время ранних испытаний привела к распространенному мнению, что протеаза ВИЧ развивает устойчивость к ингибиторам путем мутации в менее восприимчивые формы фермента (17-25).
На сегодняшний день, однако, все устойчивые к ингибиторам мутантные протеазы, "идентифицированные" в клинических образцах, были получены из следов неактивной ВИЧ-провирусной ДНК в нескольких клетках некоторых людей. Эти устойчивые к ингибиторам мутантные протеазы никогда не встречались в жизнеспособном инфекционном вирусе. Пока только специальные лабораторные условия способны продуцировать вирусные частицы, содержащие устойчивую к ингибиторам мутантную ВИЧ-протеазу. Даже здесь о жизнеспособности и инфекционности этих мутантных частиц по отношению к так называемому вирусу дикого типа не сообщалось (19,20,26,27).
Неспособность найти ингибитор-резистентную протеазу ВИЧ в инфекционном вирусе легко объясняется. Установлено, что минимальная жизнеспособная каталитическая эффективность протеазы ВИЧ составляет 2% от активности дикого типа (11,12). Однако каталитическая эффективность мутантных ферментов на много порядков ниже уровня 2% (28,29). Причина чрезвычайно низких уровней активности заключается в том, что как ингибиторы, так и субстраты связываются с одним и тем же каталитическим сайтом протеазы ВИЧ. Поскольку протеаза ВИЧ дикого типа эволюционировала до оптимального уровня активности, практически все изменения в структуре фермента, влияющие на каталитическую эффективность, смертельны для вируса. Мутации протеазы, которые снижают связывание ингибитора, приводят к еще более глубокому снижению каталитической активности. Это связано с тем, что общая каталитическая эффективность мутантной ВИЧ-протеазы определяется продуктом относительной эффективности мутантного фермента по отношению к дикому типу для всех восьми обязательных расщеплений (28). Эти восемь расщеплений можно рассматривать как восьмизначный кодовый замок. Не только протеаза ВИЧ должна сделать все 8 расщеплений, но энзим должен сделать его в правом заказе. Поэтому даже в отсутствие ингибиторов устойчивые к ингибиторам мутантные протеазы ВИЧ не приводят к жизнеспособному инфекционному вирусу. Это не конец плохих новостей для мутантного ВИЧ. Как и фермент дикого типа, восемь последовательных расщеплений заставляют устойчивые к ингибиторам протеазы быть экспоненциально чувствительными к ингибиторам, что более чем компенсирует их более слабое связывание (28).