Тема 9
Микробиология непродовольственных товаров
Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям СанПиНа 2.1.4.1074-01 на питьевую воду.
Для оценки санитарного состояния воды в ней определяют общее микробное число – не более 50 КОЕ/см3; термотолерантные колиформные бактерии – не допускаются в 100 см3; общие колиформные бактерии также должны отсутствовать в 100 см3; споры сульфитредуцирующих клостридий – не допускаются в 20 см3; колифаги – в 100 см3. Исследование питьевой воды проводят один раз в квартал при пользовании городским водопроводом и один раз в месяц при наличии собственных источников водоснабжения в воде.
Общее микробное число воды (ОМЧ) – количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при 37 0С в течение 24 часов.
К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 370С в течение 24 час.
Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые, кроме этого способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 0С в течение 24 час.
Сульфитредуцирующие клостридии (преимущественно Clostridiumperfringens) – спорообразующие анаэробные палочковидные бактерии, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре в течение 24 часов при температуре 44 0С.
Колифаги – бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса через 18±2 часа при температуре 37 0С на ее газоне на питательном агаре. Колифаги – индикаторы очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов.
Способами обеззараживания воды являются хлорирование, озонирование, обработка ультрафиолетовыми лучами.
Методика выполнения лабораторной работы
Цель работы: освоить микробиологические методы, позволяющие оценить санитарное состояние воды, тары, упаковочных материалов.
Материалы, реактивы, оборудование: термостаты; микроскопы; спиртовки; плитки; пробирки с тампонами для приготовления смывов;пинцет; пробирки со средой Кесслера; средой Кода; стерильные чашки Петри; стерильные пипетки на 1 см3; стерильные колбы на 500 см3; питательные среды: мясопептонный агар, среда Эндо, сусло-агар или среда Сабуро, лактозопептонная среда, железосульфитный агар; бактериологические петли; предметные стекла;чашки Петри; набор красок по Граму; фильтровальная бумага; мембранные фильтры; 96%-ный этиловый спирт.
Опыт № 1. Оценка санитарного состояния воды
а) Отбор проб. Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10−15 минут воду спускают, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см3). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем.
б)Определение общего микробного числа (КМАФАнМ)
Проводят по методике, описанной в разделе 7.6.
Для посева отбирают по 1 см3 воды и переносят в 2 чашки Петри и заливают расплавленной и охлажденной до 45−50 0С плотной питательной средой (МПА). После инкубации посевов подсчитывают количество колоний в каждой чашке, а затем результаты суммируют и делят на два.
в) Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранных фильтров
Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации выросших колоний.
Для анализа точно отмеряют 100 см3 воды и фильтруют этот объем через стерильный мембранный фильтр. После окончания фильтрования фильтр осторожно приподнимают фламбированным пинцетом и переносят в чашку Петри со средой Эндо. Поверхность фильтра с осевшими на ней микроорганизмами должна быть обращена вверх. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37 0С в течение 24 часов.
Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии, или выросли колонии с неровными краями и поверхностью.
При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде – темно красных, красных с металлическим блеском, а также лактозоотрицательных – розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.
Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида и делают посев на скошенный питательный агар. Посевы инкубируют при 370С в течение 16−18 часов. Далее проводят биохимические тесты с чистыми культурами: оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы при температуре 37 0С для определения общих колиформных бактерий и при 44 0С при определении термотолерантных колиформных бактерий.
г) Определение содержания общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом
Титрационный метод (метод бродильных проб) основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую накопительную среду, с последующим пересевом на дифференциально-диагностическую среду для идентификации выросших колоний.
Титрационный метод может быть использован:
− при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом бродильных проб;
− при анализе воды с большим содержанием взвешенных частиц;
− в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.
Первый этап исследования заключается в посеве 3-х объемов воды по 100 см3 в концентрированную лактозопептонную среду. Посевы инкубируют при температуре 37 0С в течение 24−48 час.для определения общих колиформных бактерий и при 44 0С – при определении термотолерантных колиформных бактерий в течение 24±2 час. Если в колбах не обнаружены признаки роста (об этом судят по отсутствию газа в поплавках), то колиформные бактерии отсутствуют в 100 см3.
На втором этапе исследований из пробирок и колб, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев петлей в сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо выдерживают в термостате при 37 0С в течение 18−20 час. Отсутствие колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дает отрицательный ответ о содержании этих микроорганизмов в исследуемом объеме воды.
д)Определение споровых сульфитредуцирующих клостридий прямым посевом
Из каждой пробы воды делают посев 20 см3в железосульфитный агар. Для этого в стерильные пробирки вносят по 10 см3 в 2 пробирки объемом 30 см3 или по 5 см3 в 4 пробирки вместимостью 15 см3. Посевы заливают горячим (75−80 0С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирки быстро охлаждают, помещая их в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 44 0С в течение 24±2 часов. Если после культивирования не наблюдается почернения среды в пробирках, то считают, что сульфитредуцирующие клостридии отсутствуют в 20 см3.
Опыт № 2. Контроль посуды и инвентаря
Для анализа санитарного состояния стеклянных бутылок и банок смыв делают путем обмывания внутренней поверхности последовательно 10 единиц посуды 20 см3 воды. Санитарное состояние бочек, бидонов, цистерн проверяют путем посева последней смывной воды. Смыв с мелкого инвентаря (мешалки, пробники, термометры и др.) готовят путем смачивания всей поверхности стерильным тампоном, а при анализе санитарного состояния стеллажей, лотков, ведер, лопат пользуются трафаретом. В смывах определяют общую бактериальную обсемененность и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка должна отсутствовать в смывах.
Опыт № 3. Контроль упаковочных материалов
Пергамент, фольгу, пленку, комбинированные материалы для упаковки пищевых продуктов разворачивают и с внутренней стороны берут смыв стерильным ватным тампоном (со 100 см3 поверхности). Определяют наличие микроскопических грибов и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка в смывах должна отсутствовать, а содержание плесеней не должно превышать 5 в 1 см3 смыва.