Сущность методов
Метод выявления и определения НВЧ бактерий вида Pseudomonas aeruginosa основан на высеве определенного количества продукта и (или) разведений пробы продукта в жидкую неселективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-
диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa.
Метод выявления бактерий вида Pseudomonas aeruginosa
Предварительное обогащение в неселективной среде
В триптон-соевый бульон или сердечно-мозговой бульон высевают анализируемую пробу, затем посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 + 2) ч.
Выделение типичных колоний
На поверхность агаризованной селективно-диагностической среды высевают культуру, полученную, посевы инкубируют при температуре (37 + 1) °С.
Посевы просматривают через (24 + 2)ч для определения присутствия колоний, типичных для бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.
Подтверждение принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa
Типичные колонии, пересевают на поверхность питательного агара для дальнейшего подтверждения принадлежности выделенных культур к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa.
Метод посева на агаризованные селективно-диагностические среды
На подсушенную поверхность агаризованной селективно-диагностической среды двух чашек Петри наносят 0,1 — 0,2 см3 суспензии.
Внесенный в чашки Петри продукт или его исходные разведения распределяют по поверхности селективно-диагностической агаризованной питательной среды стерильным шпателем.
Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре (37 + 1) °С в течение (24 + 2) ч.
Выбор типичных колоний для подтверждения
После инкубирования посевов по 9.1.3 отмечают рост типичных колоний.
На агаре с цетримидом бактерии вида Pseudomonas aeruginosa образуют колонии голубого, сине-зеленого, желто-зеленого цвета или могут быть непигментированными.
На агаре с триклозаном бактерии вида Pseudomonas aeruginosa образуют колонии синие, сине-зеленые, желто-зеленые или зеленые.
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa на селективно-диагностических средах образуют колонии разного размера, часто с неровными краями.
Из каждой чашки, на которой обнаружены типичные колонии, выбирают по пять хорошо изолированных колоний каждого типа, отличающиеся по морфологии, и пересевают на поверхность питательного агара.
Посевы инкубируют при температуре (37 + 1) °С в течение (24 + 2) ч.
Подтверждение принадлежности типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa
Принадлежность выросших культур к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa подтверждают по отношению к окраске по Граму, присутствию оксидазы и при необходимости определяют ферментацию мальтозы и редукцию нитратов.
· Окраска по Граму
Приготовление мазков из культур, выросших на скошенной поверхности питательного агара.
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa — грамотрицательные палочки.
Допускается окраску по Граму заменять тестом Грегерсена. Для этого на предметном стекле в капле 3 %-ного водного раствора калия гидроокиси эмульгируют культуру микроорганизмов, взятую из колонии с плотной среды. Если через несколько секунд взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, то это указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательным бактериям. У грамположительных бактерий слизистых нитей не образуется.
· Определение присутствия оксидазы
Применяя платиново-иридиевую петлю или стеклянную палочку, отбирают культуры, выросшие на поверхности питательного агара, и наносят штрихи на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для определения оксидазы.
Если при этом фильтровальная бумага не потемнеет в течение 10 с, то это означает, что бактерии вида Pseudomonas aeruginosa в анализируемой пробе не присутствуют и результат испытания считают отрицательным.
· Определение ферментации мальтозы
Для определения ферментации мальтозы испытуемую культуру высевают уколом в среду Гисса с мальтозой.
Посевы термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa мальтозу не ферментируют.
· Определение редукции нитратов
При постановке реакции на подтверждение редукции нитратов предварительно убеждаются в том, что сама среда не содержит нитритов. При использовании агаризованной среды реактивы наносят на поверхность скошенного нитратного агара. Для подтверждения редукции нитратов проводят посевы в пробирки с нитратной средой. Посевы термостатируют при температуре (37 + 1) °С в течение (24 + 2) ч, затем добавляют по две капли каждого из реактивов (сульфаниловой кислоты и α-нафтола по ГОСТ). Если в течение 15 мин не происходит покраснения среды, то добавляют в посев немного порошкообразного цинка и выдерживают еще 10 мин. Если после добавления цинка среда краснеет, то редукции нитратов вследствие отсутствия бактерий вида Pseudomonas aeruginosa не произошло и тест считают отрицательным. Если после добавления цинка среда не краснеет, то делают вывод о том, что редукция нитратов вследствие присутствия бактерий вида Pseudomonas aeruginosa произошла.
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa вызывают редукцию нитратов.
По результатам подтверждения к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa относят аэробные не образующие спор грамотрицательные оксидазоположительные палочки, образующие пигменты флюоресцин и пиоционин, не ферментирующие мальтозу, вызывающие редукцию нитратов.
