Макромолекулы или органеллы, незначительно различающиеся по размеру или по плотности, можно разделить центрифугированием в градиенте плотности. Для этих целей используются два метода.
При зональном центрифугировании анализируемая проба (например, белки или клетки) наслаивается тонким слоем поверх буферного раствора. В процессе центрифугирования частицы проходят через раствор, так как их плотность выше плотности раствора. Скорость движения зависит от массы и формы частиц. Центрифугирование прекращают прежде, чем частицы достигнут дна центрифужной пробирки. Затем дно прокалывают и собирают ряд фракций, содержащих различные частицы. Стабильность градиента плотности в процессе центрифугирования достигается применением растворов углеводов или коллоидного силикагеля, концентрация которых возрастает от поверхности к дну пробирки. Градиент плотности препятствует образованию конвекционных потоков, снижающих качество разделения.
При изопикническом центрифугировании пробу (например ДНК, РНК или вирусы) равномерно распределяют во всем объеме раствора (обычно CsCI). В этом случае разделение продолжается значительно дольше, чем при зональном центрифугировании. Градиент плотности создается в процессе центрифугирования за счет седиментации и диффузии. Со временем каждая частица попадает в область, соответствующую ее собственной плавучей плотности. Центрифугирование прекращают, когда устанавливается равновесие. Полученные фракции анализируют, используя подходящую измерительную технику.
Типы роторов
Угловым называется тип ротора, в котором центрифугируемые емкости (пробирки, бутыли и т.д.) не изменяют своего положения в зависимости от частоты вращения ротора. Другими словами: вращается ротор или остановлен - емкости с центрифугатом всегда остаются в первоначальном положении под определенным углом к оси вращения. Пробирки располагаются под углом к оси вращения (угол расположения пробирок от 20 до 45 градусов). В некоторых больших и тяжелых роторах имеются выемки, что позволяет уменьшить вес ротора и минимизировать нагрузку на ротор. Угловой ротор чаще всего используется для осаждения материала.
В бакетных роторах емкости с образцами загружаются в бакеты, которые устанавливаются в роторе на штифты или крестовину. Во время разгона бакетызанимают горизонтальное положение и упираются в корпус ротора, что обеспечивает их поддержку. Чаще всего для зонально-скоростного центрифугирования используют именно бакетные роторы, чтобы избежать нежелательного взаимодействия материала со стенками пробирки.
Ротор с вертикальным расположением пробирок. Во время центрифугирования пробирки в этих роторах располагаются параллельно оси вращения. В этих роторах (а также в роторах с практически вертикальным расположением пробирок) используются заглушки, которые закручиваются в гнезда с установленными пробирками. Заглушки удерживают пробирки в гнездах и обеспечивают противодействие гидростатическим силам, возникающим при центрифугировании.
Ротор с практически вертикальным расположением пробирок. В этих роторах пробирки также располагаются в пронумерованных гнездах под углом к оси вращения. Однако уменьшение угла (как правило, до 7-10 градусов) приводит к уменьшению времени центрифугирования по сравнению со временем центрифугирования в угловых роторах (с углом расположения пробирок от 20 до 45 градусов). При этом компоненты, которые не разделяются в процессе центрифугирования, оседают на дно или перемещаются в верхнюю часть пробирки. Как и в случае роторов с вертикальным расположением пробирок, в этих роторах используются заглушки, которые удерживают пробирки в гнездах и обеспечивают противодействие гидростатическим силам, возникающим при центрифугировании.
Проточный ротор. Данные роторы предназначены для центрифугирования образцов большого объема. При проточном центрифугировании в процессе вращения ротора через него постоянно прокачивается раствор образца.
В большинстве случаев зональные роторы используют для зонально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности раствора сахарозы на стадии препаративного выделения и очистки макромолекул или частиц из большого объема материала. Также зональные роторы используют для удаления белковых примесей из различных препаратов; выделения и очистки митохондрий, лизосом, полисом и белков. При разделении в градиенте плотности с использованием зонального ротора градиент и образец загружаются непосредственно в полость ротора; какие-либо пробирки и флаконы при этом не требуются.