Типы вирусных векторов, используемых в генотерапии
1. Векторы на основе ретровирусов;
2. Векторы на основе HIV-вирусов (лентивирусы);
3. Векторы на основе аденовирусов;
4. Векторы на основе аденоассоциированных вирусов;
5. Векторы на основе герпесвирусов.
Векторы на основе ретровирусов
Это небольшие рнк-содержащие вирусы, способные заражать только делящиеся клетки, в которых они репродуцируются. Вирусный геном (в виде провируса) встраивается в ДНК клетки-мишени. Поэтому ретровирусные векторы теоретически способны обеспечить длительную экспрессию трансгенов в некоторых типах клеток. Большинство ретровирусных векторов получено на основе вируса лейкоза мышей Молони. Геном вируса изменен так, чтобы избежать экспрессии вирусных белков в зараженных клетках, что предотвращает развитие иммунного ответа против этих клеток. Поскольку эти вирусы заражают только делящиеся клетки, ретровирусные векторы используют в основном для трансфекции клеток ex vivo или для экспериментального лечения злокачественных новообразований.
Жизненный цикл. Геном ретровирусов состоит из плюс-цепи РНК. Оболочка ретровирусов образуется из мембраны зараженной клетки и содержит вирусные белки. В зараженной клетке путем обратной транскрипции на матрице вирусной РНК происходит образование двухцепочечной ДНК (провируса), которая затем встраивается в клеточный геном. Это обеспечивают вирусные белки - обратная транскриптаза и интеграза. Для проникновения провируса в ядро необходимо разрушение ядерной оболочки клетки, происходящее в ходе митоза. Встроившийся в клеточный геном провирус использует аппарат клетки для транскрипции вирусныхмРНК, их процессинга и трансляции. Жизненный цикл вируса завершается с синтезом новых плюс-цепей РНК на матрице провируса. Специфическая последовательность в молекуле РНК (psi) дает сигнал сборки, после чего новые вирусы отпочковываются от поверхности клетки.
В ретровирусный вектор может быть включено до 8000 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Поскольку рекомбинантный вирус не может синтезировать вирусные мРНК, то в трансфицированных клетках отсутствует и синтез вирусных белков, которые могли бы вызвать иммунный ответ. Вместе с геном, предназначенным для лечения, в вектор можно ввести промотор и энхансер, обеспечивающие эффективную экспрессию трансгена и, в ряде случаев, ее тканеспецифичность.
Энхансер (англ. enhancer — усилитель, увеличитель) — небольшой участок ДНК, который после связывания с ним факторов транскрипции стимулирует транскрипцию с основных промоторов гена или группы генов.
После удаления генов, кодирующих вирусные белки и обеспечивающих репродукцию вируса, вирус способен репродуцироваться только в специально созданных линиях упаковывающих клеток, синтезирующих эти белки После введения рекомбинантной ДНК провируса в упаковывающие клетки последние начинают производить ретровирусный вектор. ДНК провируса вводят в виде плазмиды.
Клетки-мишени:
Экотропность - заражаются только клетки одного вида, например, мышей.
Амфотропность - заражаются клетки не только мышей, но и других млекопитающих, в том числе - человека.
Псевдотипирование - упаковка вирусного генома в оболочку, содержащую белки другого вируса, позволяет расширить круг клеток-мишеней.
HIV-вирусы (лентивирусы)
Вирусы, относящиеся к этому подсемейству ретровирусов, способны заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Из лентивирусов лучше всего изучен ВИЧ-1, а векторы, полученные на его основе, теоретически обладают рядом преимуществ перед описанными ретровирусными векторами. Особенно многообещающей является их способность к высокоэффективной трансфекции стволовых кроветворных клеток.
Конструкция и получение вектора. Лентивирусные векторы лишены способности к репродукции благодаря удалению из генома ВИЧ-1 некоторых дополнительных генов, поэтому для их получения используют упаковывающие клетки, в которых независимые гены кодируют необходимые для сборки вируса компоненты. Это существенно снижает риск рекомбинации при получении вектора, в результате которой теоретически возможно восстановление способности вируса к репродукции. Удаление гена tat и длинных концевых повторов (LTR) также снижает риск восстановления способности к репродукции при получении вектора или in vivo.
Клетки-мишени. Лентивирусные векторы способны заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, например стволовые кроветворные клетки или специализированные клетки - мышечные, нейроны, гепатоциты, фоторецепторы сетчатки.
Применение лентивирусных векторов почти не вызывает воспаления или других признаков поражения тканей.
Безопасность. Поскольку лентивирусные векторы получают на основе генома ВИЧ-1, особенную озабоченность вызывает риск рекомбинации, восстанавливающей способность к репродукции. Репродуцирующийся лентивирусный вектор теоретически опасен тем, что он может вызвать инсерционный мутагенез или приобрести свойства исходного ВИЧ-1.