Транскрипцией называется биосинтез РНК на матрице ДНК. Это первая стадия реализации генетической информации, в процессе которой определенные участки нуклеотидной последовательности ДНК “переписываются” в комплементарные одноцепочечные молекулы РНК. В результате транскрипции образуются мРНК, кодирующие аминокислотные последовательности белков, а также тРНК, рРНК и другие виды РНК, выполняющие структурные, регуляторные и каталитические функции. В основе транскрипции лежит принцип комплементарности азотистых оснований полинуклеотидных цепей ДНК и РНК. Процесс транскрипции осуществляется с участием соответствующих ферментов – РНК-полимераз. Кроме того, для осуществления процесса необходимы белки-регуляторы.
У подавляющего большинства организмов ДНК представляет собой двухцепочечные молекулы, составленные из комплементарных (но не идентичных) цепей, транскрипции подвергается обычно одна из них, носящая название матричной цепи:
ДНК 5´-АTGATTGGGGCTCTA-3´ смысловая цепь
3´-TACTAACCCCGAGAT-5´ матричная цепь
↓ транскрипция
РНК AUGAUUGGGGCUCUA
Различные РНК обычно транскрибируются с одной из цепей ДНК, однако у некторых геномов (например бактериофаг Т4) матрицей могут служить разные цепи ДНК.
Синтез РНК (транскрипция) осуществляется ферментами ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. РНК-полимеразы, так же как и ДНК-полимеразы используют в качестве субстратов нуклеозидтрифосфаты и активны только в присутствии ионов Mg2+. В отличие от ДНК-полимераз РНК-полимеразы не нуждаются в праймере. Рост цепи РНК происходит путем последовательного присоединения рибонуклеотид-5´-монофосфатов к 3´-гидроксильной группе рибозы предшествующего нуклеотида (т.е. в направлении 5´-3´). Последовательность нуклеотидов в синтезируемом РНК-транскрипте определяется комплементарными взаимодействиями азотистых оснований, используемых для синтеза рибонуклеотидов, с азотистыми основаниями матричной цепи ДНК.
У всех без исключения организмов процессу транскрипции подвергается единовременно не вся молекула, а только определенные ее участки – транскриптоны. Они ограничены двумя последовательностями, которые называются промотором (зона начала транскрипции)и терминатором (зона остановки транскрипции). Транскриптоны бактерий называют оперонами. Опероны обычно включают в себя нуклеотидные последовательности, кодирующие структуру нескольких белков, называемые цистронами или структурными генами. Поэтому синтезируемая на оперонах бактерий мРНК является полицистронной и используется для синтеза нескольких белков (обычно это ферменты одного метаболитического пути).
Бактериальные РНК-полимеразы – сложные белки, состоящие из нескольких субъединиц. Наиболее изученный фермент кишечной палочки содержит 5 субъдиниц: две субъединицы α и по одной β, β´, ώ (основа фермента – кор). После присоединения к кору еще одной субъединицы – σ-фактора – образуется холофермент РНК-полимераза. Установлено, что при присоединении к ДНК фермент “закрывает” 60 пар нуклеотидов.
Процесс транскрипции состоит их 3 этапов: инициации, элонгации и терминации.
Функцией холофермента РНК-полимеразы является связывание с промотором и инициация транскрипции. Кор-фермент (α,α,β,β´) осуществляет элонгацию, т.е. собственно синтез РНК. Для терминации транскрипции в некоторых случаях требуется присоединение к кор-ферменту фактора терминации – ρ-фактора.
Инициация транскрипции происходит в зоне промотора – особой нуклеотидной последовательности ДНК, которая содержит сигнал начала транскрипции. В большинстве промоторов E.coli присутствуют две последовательности: последовательность 5´-ТАТАТТ-3´ (расположена на расстоянии -10 нуклеотидов от точки начала транскрипции, носит название Прибнов-бокс) и последовательность 5´-TTGACA-3´ (расположена на расстоянии -35 нуклеотидов от точки старта транскрипции).
Для инициации транскрипции необходимо присоединение к кор-ферменту σ-фактора с образованием холофермента. Основная функция σ-фактора состоит в том, чтобы обеспечить стабильное связывание РНК-полимеразы с промотором, а не с другими участками ДНК. Минимальный фермент имеет сродство к ДНК; в основе этого сродства лежит электростатическое взаимодействие между положительно заряженным белком и отрицательно заряженной ДНК. Случайная последовательность ДНК, которая связывается РНК-полимеразой, называется слабым участком связывания, а комплекс ДНК-фермент закрытым, так как ДНК находится в таком комплексе в двухцепочечной форме.
Сигма-фактор принципиально изменяет характер взаимодействия РНК-полимеразы с ДНК. У холофермента сродство к любым последовательностям ДНК, кроме промотора, резко снижено. Сигма-фактор сообщает ферменту способность к узнавать специфические участки связывания (промоторы), путем присоединения к последовательности -35.
Взаимодействие холофермента с промотором начинается с образования двойного закрытого комплекса (включает 2 компонента -ДНК и фермент, ДНК имеет двухцепочечную форму). Двойной закрытый комплекс затем переходит в двойной открытый (в нем небольшой фрагмент ДНК расплетается в области Прибнов-бокса) комплекс. Следующим шагом является включение двух первых нуклеотидов РНК и образование фосфодиэфирной связи между ними. Это приводит к формированию тройного открытого комплекса между ферментом, ДНК и синтезирующейся РНК. После образования тройного комплекса инициация заканчивается и сигма-фактор отделяется (он используется клеткой многократно- т.н. цикл сигма-фактора).
Элонгацию осуществляет минимальный фермент, в котором сигма-фактор замещается фактором элонгации (например белок NusA E.coli). Перемещаясь вдоль двойной спирали ДНК РНК-полимераза непрерывно раскручивает спираль впереди того участка, где происходит синтез РНК. Затем фермент вновь закручивает ДНК позади участка полимеризации и готовая часть транскрипта выводится из комплекса через особый канал, свойственный РНК-полимеразе. Скорость синтеза РНК у бактерий составляет примерно 30 нуклеотидов в секунду.
Терминация транскрипции определяется особой нуклеотидной последовательностью в ДНК, расположенной в зоне терминатора (стоп-сигнал). В стоп-сигнале имеется GC-богатый участок, обладающий центральной симметрией и представляющий собой самокомплементарную нуклеотидную последовательность (инвертированные повторы).Такая последовательность называется палиндромом:
GGT----ACC
CCA---- TGG
Копии повтора, находящиеся в одной и той же цепи ДНК взаимно комплементарны, если их прочитывать в противоположных направлениях. При образовании комплементаных пар возможно возникновение структуры шпильки в РНК или структуры креста в ДНК.
За палиндромом часто распологается последовательностьиз 4-8 адениловых нуклеотидов (ро-независимые терминаторы). Транскрипция в GC-богатой области приводит к образованию в РНК-транскрипте устойчивого элемента вторичной структуры – шпильки. Такая шпилька нарушает прочность связи в комплексе ДНК-РНК, кроме того, транскрипция олиго(А)- последовательности приводит к образованию дуплекса из очень непрочных пар A-U, что также приодит к разрушению комплекса ДНК-РНК. Таким образом, сразу после образования шпильки происходит высвобождение новосинтезированной РНК, отделение РНК-полимеразы и восстановлению двуспиральной структуры ДНК.
Часть терминаторов узнается РНК-полимеразой только с помощью белкового фактора терминации ρ(ро)-фактора (ро-зависимые терминаторы). Он присоединяется к продукту непосредственно перед терминатором. Ро-фактор обладает АТФазной активностью, во время его работы высвобождается энергия, которая изменяет его конформацию, что, вероятно, способствует вытеснению РНК из транскрипционного комплекса.
Регуляция транскрипции
Бактериям необходимо уметь быстро отвечать на изменения в окружающей среде. Их выживаемость зависит от способности переключать метаболизм с одного субстрата на другой, поскольку в условиях их обитания поступление питательных веществ может постоянно меняться. Одноклеточные эукариоты способны проявлять такую же зависимость от непрерывно меняющихся условий среды. Более сложно организованные многоклеточные организмы имеют более постоянный набор метаболитических путей и могут не отвечать на изменение внешних условий перестройкой своего метаболизма.
Легкая приспособляемость – большое преимущество бактерий. Однако при этом им необходима экономичность, поскольку бактерия, которая в ответ на изменение условий окружающей среды использует пути, требующие больших энергетических затрат, может оказаться в невыгодном положении. Очевидно, что энергетически невыгодно производить все ферменты метаболитических путей, если они не используются в данный момент из-за отсутствия субстрата. Действительно доказано, что бактерии не синтезируют ферментов того или иного пути в отсутствие соответствующего субстрата, но способны в любое время начать их синтез при появлении такового.
Этим объясняются главные особенности организации бактериальных генов – их объединение в кластеры таким образом, что все ферменты, необходимые для осуществления определенного пути биосинтеза, детерминируются генами, сцепленными друг с другом. Вся группа генов транскрибируется в одну полицистронную мРНК, которая последовательно транслируется рибосомами с образованием каждого их белков.
Транскрипция у прокариот регулируется преимущественно на стадии инициации и связана с деятельностью регуляторных белков – активаторов и репрессоров трансткрипции. Наиболее изученными оперонами бактерий являются лактозный и триптофановый опероны.