Практикум 6. Иммунологические реакции.
Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:
1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;
2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации.
ИР выявляют образование иммунного комплекса АГ+АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГ+АТ, утративший растворимость в изотонических растворах. Вторая стадия — неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.
При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглютината, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках латекса или угля и др.)
Скорость реакции зависит от:
- оптимального соотношения АГ и АТ;
- степени специфичности АГ и АТ;
- рН среды (7,2-7,4)
- концентрации электролитов (0,85 % натрия хлорида).
Рассмотрим некоторые примеры применения ИР:
Брюшной тиф и паратифы: диагностика.
Возбудителями являются несколько серотипов Salmonella enterica - Salmonella typhi (брюшной тиф), Salmonella paratyphi A (паратиф A), Salmonella paratyphi В, часто называемая Salmonella schottmuelleri (паратиф В), иногда Salmonella typhimurium. Источником инфекции, как правило, бывают больные или носители. Инфекция передается преимущественно через обсемененную воду, реже - через загрязненные носителями пищевые продукты. Брюшной тиф в настоящее время широко распространен в Перу, в Александрии (Египет), в Джакарте (Индонезия), в Индии, Пакистане и Непале.
Определение нормальных антител к брюшнотифозному антигену в реакции агглютинации.
Для определения нормальных антител берут у здорового человека шприцем кровь из локтевой вены в количестве 2-3 мл и дают ей свернуться. Образовавшийся сгусток отделяют, а сыворотку отсасывают в чистую пробирку и готовят ряд разведений от 1:10 до 1:160 следующим образом: во все пробирки разливают по 1 мл (20 капель) физиологического раствора, затем в 1-ю пробирку этой же пипеткой наливают 1 мл сыворотки, разведённой 1:5, перемешивают с физиологическим раствором, получают разведение 1:20. Также получают разведения 1:40, 1:30 и 1:160.
В отдельную контрольную пробирку наливают 1 мл физиологического раствора без сыворотки (контроль антигена). Во все пробирки закапывают по 2 капли брюшнотифозного диагностикума. Штатив ставят в термостат на 2 часа при 37 °С, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре.
|
При учёте реакции сначала просматривают контрольную пробирку. В ней при лёгком встряхивании наблюдается равномерное помутнение, хлопьев не должно быть. Опытные пробирки просматривают одновременно с контрольной, держа в одной руке и встряхивая. При положительной реакции обнаруживаются хлопья из склеенных бактерий. Учитывают максимальное разведение сыворотки, при котором произошла отчетливая агглютинация (титр сыворотки).
Реакция агглютинации Видаля для серодиагностики брюшного тифа.
Специфические антитела (агглютинины) обнаруживаются в крови больного со 2-ой недели болезни. Для постановки реакции Видаля берут шприцем кровь из локтевой вены в количестве 2-3 мл и дают ей свернуться. Образовавшийся сгусток отделяют, а сыворотку отсасывают в чистую пробирку и готовят из неё 3 ряда разведений сыворотки больного от 1:100 до 1:800 следующим образом: во все пробирки разливают по 1 мл (20 капель) физиологического раствора; затем этой же пипеткой наливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:50 в первую пробирку, перемешивают с физиологическим раствором, таким образом получают разведение 1:100, Из этой пробирки переносят 1 мл сыворотки в следующую пробирку, перемешивают с физиологическим раствором, получают разведение 1:200 также получают разведения 1:400 и 1:800 в каждом из трёх рядов. Реакция агглютинации Видаля ведётся в объеме 1 мл жидкости, поэтому из последней пробирки после смешения жидкости удаляют 1 мл. В отдельную контрольную пробирку наливают 1 мл физиологического раствора без сыворотки. Этот контроль ставится для проверки возможности спонтанной агглютинации антигена (диагностикума) а каждом ряду (контроль антигена). Во все пробирки каждого ряда, соответствующего надписям, закапывают по 2 капли диагностикума. Штатив ставят в термостат на 2 часа при 37° С и затем на сутки оставляют при комнатной температуре. Учёт реакции производится на следующем занятии.
В сыворотках больных могут быть как специфические, так и групповые антитела, которые различаются по высоте титра. Специфическая реакция агглютинации идёт обычно до более высокого титра. Реакция считается положительной, если агглютинация произошла хотя бы в первой пробирке с разведением 1:200. Обычно она наступает в больших разведениях. Если наблюдается групповая агглютинация с двумя или тремя антигенами, то возбудителем болезни считают того микроба, с которым произошла агглютинация в наиболее высоком разведении сыворотки.
Недостатки реакции:
1. реакция положительна, начиная со 2-ой недели заболевания;
2. реакция положительна в 3-х случаях: у больных (инфекционная реакция), у переболевших (анамнестическая) и у вакцинированных (прививочная).
Для дифференциации реакций прибегают к повторной постановке ее через 5-6 дней. У больных отличается резкое нарастание титра антител. При прививочной и анамнестической реакциях титр антител не изменится.
Реакцию Видаля можно поставить одновременно с Н- и О-антигенами бактерий брюшного тифа, что помогает дифференцировать инфекционную реакцию от прививочной, так как у привитых обнаруживаются только Н-антитела, О-агглютинин в высоком титре отмечается только в разгар болезни.
Сибиреязвенная бацилла – вызывает зоонозную инфекцию сибирскую язву. Человек заражается контактным путем (при уходе за больными животными, убое, переработке животного сырья), реже — алиментарным путем (при употреблении мяса и других животноводческих продуктов), воздушно-пылевым путем. Резервуар и источник инфекции — крупный и мелкий рогатый скот, лошади, верблюды, свиньи.
Реакция термопреципитации по Асколи при определении сибереязвенного гаптена в загнившем материале (трупы животных).
Реакция Асколи ставится для диагностики сибирской язвы с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь: преципитиноген — гаптен Bacillus anthracis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая сибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.
Приготовление термопреципитиногена (АГ).
1. 8 колбочку, содержащую 1 г измельчённой кожи или 1 мл культуры Bacillus anthracis, налить 10 мл физиологического раствора.
2. Колбу поместить в кипящую баню на 30-45 минут.
3. Профильтровать. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен.
Для реакции преципитации фильтрат разводится в 100 раз и более.
Постановка реакции кольцепреципитации.
1) В преципитационную пробирку наливается 0,3 мл преципитирующей сыворотки (АТ) цельной или в разведении 1:5, 1:10.
2) По стенке пробирки осторожно наслаивается преципитиноген (АГ).
Реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо выпадающего преципитата не позднее 5-15 минут.
При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:
а) антиген и физиологический раствор;
б) специфическая сыворотка и физ. раствор;
в) антиген и неспецифическая сыворотка.
Во всех контрольных пробирках помутнения не должно быть. Для реакции преципитации пользуются специальными преципитационными пробирками высотой 40-60 мм и диаметром 4-5 мм, преципитация в узких пробирках наступает значительно скорее и проявляется более чётко, чем в обычных пробирках, их тщательно моют и высушивают, чтобы стекло их было совершенно прозрачным и сухим.
Ответим на вопросы (устно):
1. Опишите стадии ИР.
2. От чего зависит скорость ИР?
3. Приведите пример реакции агглютинации.
4. Если наблюдается групповая агглютинация с двумя или тремя антигенами в реакции Видаля, то какого возбудителя считают причиной болезни?
5. К какому типу ИР относится реакция Асколи: к реакции агглютинации, реакции непрямой агглютинации, реакции преципитации?
6. Какие пробирки используют для постановки реакции Асколи и почему?