Транскрипция ДНК. Воспроизводство генетического материала обеспечивается репликацией ДНК, приводящей к ее самокопированию в виде двух идентичных дочерних молекул. Однако проблема химических основ наследственности включает и вопрос о том, каким образом осуществляется гетерокаталитическая функция ДНК, т.е. экспрессия генов. Сформулированная Ф.Криком так называемая центральная догма молекулярной биологии утверждает, что перенос генетической информации осуществляется: от ДНК к ДНК (путем репликации); от ДНК через информационную, или матричную РНК (иРНК) к белку.
Несмотря на то, что в последнее десятилетие на примере РНК-содержащих вирусов была доказана возможность переноса генетической информации в направлении от РНК к ДНК с помощью процесса обратной транскрипции, основным путем экспрессии генов является их транскрипция, т.е. синтез одной цепи иРНК по матрице ДНК, и последующая трансляция этой иРНК на рибосомах, т.е. сборка аминокислот в полипептидную цепь на матрице иРНК. В клетках эукариот эти процессы отделены друг от друга в пространстве и во времени, поскольку первый происходит в окруженном ядерной мембраной ядре, откуда синтезированная иРНК поступает в цитоплазму, а затем начинает транслироваться на рибосомах. У прокариот с их плавающей в цитоплазме хромосомой (нуклеоидом) указанные процессы не разобщены и трансляция генных транскриптов, т.е. молекул иРНК, начинается до полного завершения их синтеза одновременно на многих рибосомах. Сопряженность транскрипции и трансляции у бактерий приводит к тому, что при 370 С за 1 секунду синтезируется »15 кодонов (т.е. триплетов нуклеотидов в иРНК, кодирующих определенную аминокислоту), а за одну минуту- 2500 нуклеотидов. Это хорошо согласуется со скоростью синтеза белка, равного при 370 С примерно 15 аминокислот в 1 с. С момента инициации экспрессии гена его иРНК появляется в клетке через 2,5 мин, а соответствующий белок - еще через 30 с.
Как правило, лишь одна цепь ДНК, называемая антикодирующей, служит матрицей для синтеза комплементарной молекулы иРНК, осуществляемого ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Противоположная ей цепь, последовательности нуклеотидов в которой совпадает с последовательностями иРНК, называется кодирующей. Подобно синтезу ДНК, синтез иРНК также идет в направлении 5¢-3¢, поэтому он всегда начинается с 3¢-конца антикодирующей цепи. Следует иметь в виду, что у двух разных генов, расположенных на одной молекуле ДНК в пределах одной хромосомы, даже если они сцеплены друг с другом, кодирующая цепь может не совпадать. Это означает то, что транскрипция молекулы ДНК, образующей ряд генов, происходит с переменой матрицы. Вместе с тем в каждом данном гене транскрибируется лишь одна цепь.
Существование иРНК было теоретически доказано Уотсоном и Криком при рассмотрении вопроса о том, каким образом заложенная в двуспиральной ДНК генетическая информация реализуется при синтезе белка. Экспериментально же это впервые доказано в работе Э. Волкина и Л. Астрахана (1962), исследовавших процесс синтеза белка в клетках E.coli, инфицированных фагом Т2. Они обнаружили, что при фаговой инфекции в бактериальных клетках резко усиливается синтез молекулы РНК, комплементарной по своему составу одной из цепей ДНК фага Т2, но не ДНК E.coli. Время полураспада этой РНК составляет всего несколько минут. Позднее in vitro было показано, что такие короткоживущие РНК направляют синтез специфических фаговых белков.
У эукариот прямые доказательства синтеза иРНК в ядре и ее последующего перехода в цитоплазму были получены с помощью импульсного мечения вновь синтезирующейся РНК 3Н-уридином и последующей ауторадиографии. Такие эксперименты были проведены, в частности, на клетках водорослей Tetrahymena.
Катализирующие синтез иРНК-полимеразы обычно представляют собой сложные белки. Так, один из наиболее изученных ферментов этого типа - РНК-полимераза E. сoli - имеет Мr 480 000 и состоит из 5 полипептидных цепей, из которых 4 (2a, b, b¢) образуют стержень, или кор-фермент. Способность РНК-полимеразы распознавать начало данного гена и присоединяться к специфическому для каждого гена сайту инициации транскрипции, или промотору, определяется пятым полипептидом d (сигма-фактор). У эукариот известно 3 типа РНК-полимераз, ответственных за синтез различных классов РНК. Наиболее активна РНК-полимераза I, обнаруженная в ядрышках. Она транскрибирует лишь гены, кодирующие рРНК (т.е. РНК, входящие в состав рибосом), что составляет 50-70 % от общего синтеза РНК. РНК-полимераза II локализована в нуклеоплазме и синтезирует 20-40 % всей клеточной РНК, в том числе РНК-предшественники иРНК в виде гетерогенной (состоящей из различных молекул) ядерной РНК. РНК-полимераза III также находится в нуклеоплазме и ответственна за синтез большей части мелких ядерных РНК и транспортных РНК.
Этапы транскрипции. Различают три этапа транскрипции: инициацию, элонгацию и терминацию. Инициация. Последовательность ДНК, транскрибирующаяся в одну иРНК, начинающаяся просмотром на 5¢-конце и заканчивающаяся терминатором на 3¢-конце, является единицей транскрипции и соответствует современному понятию “ген”. Контроль экспрессии генов может осуществляться на этапе инициации транскрипции. На этом этапе РНК-полимераза распознает промотор - фрагмент длиной 41-44 п.н. Транскрипция ДНК происходит в направлении 5¢-3¢, или слева направо. Последовательности, лежащие вправо от стартового нуклеотида, с которого начинается синтез иРНК, обозначаются номерами со знаком “+” (+1, +2 и т.д.), а находящееся левее - со знаком “-” (-1,-2 и т.д.). Таким образом, область ДНК, к которой присоединяется РНК-полимераза, занимает участок с координатами от -20 до +20. Минимальный участок, связанный с РНК-полимеразой, состоит у E.coli из 12 п.н. Во всех промоторах присутствуют одни и те же нуклеотидные последовательности, называемые консервативными. Такие последовательности служат сигналами, распознаваемыми РНК-полимеразами. Стартовая точка обычно, хотя и не всегда, представлена пурином (чаще аденином, чем гуанином). Сразу же влево от нее располагаются 6-9 п.н., известные как последовательность (или ящик) Прибнова: ТАТААТ. Она может несколько варьировать, но первые два основания (ТА), по крайней мере, у E.coli, встречаются в большинстве промоторов. Предполагается, что, поскольку ее образует участок богатый АТ-парами, связанными двумя, а не тремя, как ГЦ-пары, водородными связями, ДНК в этом месте легче разделяется на отдельные нити. Это создает условия для функционирования РНК-полимеразы. Наряду с этим последовательность Прибнова нужна для ориентирования РНК-полимеразы таким образом, чтобы синтез иРНК шел слева направо, т.е. в направлении 5¢-3¢. Центр “ящика Прибнова” приходится на нуклеотид в положении -10. Близкая по составу последовательность расположена в другом участке с центром в положении -35, т.е. на расстоянии 35 п.н. от стартовой точки. Этот участок, состоящий из 9 п.н., обозначают как последовательность 35, или район распознавания. Он является сайтом, к которому присоединяется δ-фактор, тем самым определяя эффективность, с которой РНК-полимераза распознает определенный промотор. Есть промоторы, с которых РНК-полимераза не может начать транскрипцию без помощи специальных белков. Одним из них служит фактор САР, или CRP.
Изменение специфичности распознавания субстрата РНК-полимеразой может серьезно отразиться на жизнедеятельности организма. Так, образование спор сенной палочки (Bacillus subtilis) зависит от того, какой из δ-факторов функционирует. Замена δ-фактора с Мr 55000 на δ-фактор с Мr 37000 и 29000 при неизменности кор-фермента приводит к тому, что РНК-полимераза начинает распознавать и транскрибировать хромосомные гены, ответственные за ранние и последующие этапы спорообразования. С заменами δ-фактора связано также переключение транскрипции с одних генов на другие у фага SPOI B. subtilis. Каждый δ-фактор распознает собственные, характерные для него последовательности в промоторе с координатами- 10 и -35. Недавно это продемонстрировано и на E.coli. Известно, что при инкубации при повышенной температуре (420 С) в клетках E.coli начинает интенсивно экспрессироваться группа генов, объединяемая общим названием “гены теплового шока”. В отличие от других генов E.coli, транскрибирующихся РНК-полимеразой, содержащей δ-фактор с Мr 70000, гены теплового шока транскрибируются комплексом кор-фермента РНК-полимеразы с иным δ-фактором с Мr 32000. Примечательно, что в эту группу генов входит и ген, кодирующей δ-фактор с Мr 70000. Следовательно, второй δ-фактор придает клетке дополнительные возможности для избирательной регуляции генной активности, направленной, в частности, на усиление продукции основного δ-фактора, повышающее уровень транскрипции в клетке в ответ на изменение внешних условий.
У эукариот более подробно изучены промоторы, взаимодействующие с РНК-полимеразой II. Они содержат три гомологичных участка в районах с координатами -25, -27, а также в стартовой точке. Стартовым основанием служит аденин, фланкированный с обеих сторон пиримидинами. На расстоянии 19-27 п.н. влево от этого участка расположены 7 п.н. ТАТАА (или Т)АА (или Т), известных как последовательность ТАТА, или “ящик Хогнесса”. Часто он окружен участками, богатыми ГЦ-парами. Последовательность ТАТА напоминает “ящик Прибнова” у прокариот, но расположена в среднем на 15 п.н. левее стартовой точки. Еще левее в положении от -70 до -80 находится последовательность ГТЦ (или Т) ЦААТЦТ, называемая также “ящик ЦААТ”. Предполагается, что последовательность ТАТА контролирует выбор стартового нуклеотида, а ЦААТ - первичное связывание РНК-полимеразы с ДНК-матрицей.
Элонгация. Стадия элонгации иРНК имеет ряд аналогий с элонгацией ДНК. В качестве предшественников для нее необходимы рибонуклеозидтрифосфаты. Этап элонгации транскрипции, т.е. рост цепи иРНК, происходит путем присоединения рибонуклеозидмонофосфатов к 3¢-концу цепи с одновременным освобождением пирофосфата. Копирование у эукариот обычно осуществляется на ограниченном участке ДНК (т.е. в пределах гена), хотя у прокариот в ряде случаев транскрипция может проходить последовательно через несколько сцепленных генов (цистронов), формирующих единый оперон, и с одного общего промотора. В таком случае образуется полицистронная иРНК.
Терминация. Транскрипция завершается в специфическом участке ДНК, содержащем терминирующую последовательность. В клетках E.coli выявлен особый белок (ро-фактор), повышающий точность терминации. Белок присоединяется к 5/-концу растущей иРНК и продвигается по ней, постепенно приближаясь к ДНК и как бы преследуя РНК-полимеразу. В момент, когда РНК-полимераза останавливается в сайте-терминаторе, фермент захватывается ро-фактором и сбрасывается с ДНК. Терминатор содержит особую последовательность оснований, прочитывающуюся одинаково в обеих цепях ДНК, но в противоположных направлениях. Такие симметричные структуры, называемые палиндромами, встречаются в различных участках ДНК и играют важную регуляторную роль. Палиндромы представляют собой районы двойной симметрии, поскольку ось симметрии проходит у них таким образом, что с каждой ее стороны находится одна и та же последовательность, но с противоположной ориентацией. Такие последовательности называют инвертированными повторами. Повторы в ДНК или РНК на небольшом участке изменяют их вторичную структуру, придавая ей форму креста или шпильки. Они распознаются различными ферментами в качестве регуляторных сигнальных элементов. Так, РНК-полимераза останавливается на ДНК, как только синтезируемая ею иРНК образует структуру шпильки, указывающую на то, что в данном участке ДНК находится палиндром.
Сплайсинг про – иРнк у эукариот. Сравнение структуры ДНК, соответствующей ей иРНК у эукариот, привело к открытию прерывистого строения генов. Оказалось, что гены эукариот состоят из экзонов – последовательностей нуклеотидов, представленных в иРНК, и интронов – последовательностей, отсутствующих в иРНК. Отсюда было сделано заключение, что процесс экспрессии генов у эукариот включает этап, которого нет у бактерий: ДНК детерминирует синтез копии РНК, соответствующей последовательностям генома, однако это еще только РНК – предшественник, или про – иРНК. Непосредственно для образования белка она не используется. Для того чтобы РНК – предшественник превратилась в транслирующую иРНК, она должна пройти созревание, или процессинг. Сначала из РНК – предшественника должны вырезаться последовательности, соответствующие интронным участкам ДНК. Отграничение интронных последовательностей от экзонных подчиняется «правилу Шамбона»: интрон начинается с пары ГУ, а заканчивается парой АГ. После вырезания интронов, оставшиеся последовательности РНК, соответствующие экзонам в ДНК, объединяются между собой с образованием зрелой иРНК. Этот процесс называют сплайсингом(сшиванием) иРНК. Сплайсинг приводит к тому, что, хотя порядок расположения триплетов в эукариотическом гене соответствует порядку расположения кодируемых ими аминокислот в белке, расстояние между триплетами внутри гена не совпадает с расстояниями между соответствующими аминокислотами в белке. В результате сплайсинга иРНК составляет по длине лишь 1/10 первоначального транскрипта.
Регуляция действия генов. В любой клетке различие между ее фенотипом и генотипом определяется механизмами регуляции работы генов, кодирующих структуру полипептидов, белков, рРНК и тРНК. Такие гены называют структурными. Именно регуляцией активности структурных генов объясняется тот факт, что, несмотря на идентичность генотипов клеток многоклеточного организма, они значительно различаются по строению и функции. Переключение синтеза с одних белков на другие лежит в основе всякого развития, будь то репродукция вирусов в зараженных клетках, рост и спорообразование у бактерий, развитие эмбрионов или дифференцировка тканей. На каждом этапе этих процессов синтезируются специфичные белки.
Известно несколько типов механизмов, с помощью которых один и тот же набор генов в неодинаковых условиях жизнедеятельности организма и на разных стадиях развития детерминирует синтез белков. Регуляция экспрессии (выражения) генов может осуществляться на нескольких уровнях: генном, транскрипционном, трансляционном и функциональном. Первый из них связан с изменением количества или локализации генов, контролирующих данный признак. Второй определяет, какие и сколько иРНК должны синтезироваться в данный момент. Третий обеспечивает отбор иРНК, транслирующихся на рибосомах. Четвертый связан с аллостерической регуляцией активности ферментов. Наконец, контроль действия генов может осуществляться путем посттрансляционной модификации полипептидов, посттранскрипционной модификации иРНК и другими путями.
Рассмотрим подробнее транскрипционный уровень регуляции, в отношении которого имеется большое число данных, полученных главным образом на бактериях.
Индукция и репрессия генов. Действующие в клетках про - и эукариот регуляторные механизмы обеспечивают: Возможность включения или выключения экспрессии гена в ответ на изменение внешних условий; Программированное каскадное включение экспрессии многих генов. Первый тип регуляции наиболее полно изучен у бактерий. У E.coli ферменты, обеспечивающие утилизацию сахаров в качестве единственных источников углерода и азота, синтезируются лишь в ответ на появление в средеиндуктора–субстрата,которым служит соответствующий сахар. До появления субстрата в среде ген, ответственный за синтез фермента, осуществляющего его гидролиз, неактивен, или репрессирован. Под действием индуктора происходит дерепрессия гена: он включается (индуцируется).
Выключение генов (репрессия) также может вызываться факторами внешней среды. Так, большинство генов, кодирующих ферменты синтеза аминокислот у E.coli или S. typhimurium, функционируют, когда в среде культивирования отсутствуют соответствующие аминокислоты. При выращивании в питательной среде, содержащей достаточное для роста количество этих же аминокислот, экспрессия кодирующих генов подавляется. Эти примеры показывают существование двух групп генов (и, соответственно, ферментов). Одни из них в норме репрессированы, и их дерепрессия происходит под влиянием индукторов, другие находятся в дерепрессированном состоянии и репрессируются собственными продуктами. Несмотря на это различие, принципиальные механизмы регуляции обеих групп генов сходны – они действуют на уровне транскрипции и будут рассмотрены далее на примере генов, контролирующих сбраживание лактозы и биосинтез некоторых аминокислот у бактерий.
Регуляция второго типа, обеспечивающая запуск «цепной реакции» включения многих генов, обнаружена у фагов, инфицировавших клетки бактерий. При сравнении наборов фаговых иРНК были открыты «ранние» и «поздние» фаговые гены, причем каждая группа генов функционирует лишь на определенной стадии репродукции фага.
Следует отметить, что оба типа регуляции осуществляются в отношении лишь тех генов, постоянное функционирование которых нежелательно для клетки, поскольку при этом расходуется энергия, необходимая для ее роста и размножения в условиях, когда продукты, кодируемые этими генами, не требуются (например, синтез ферментов, расщепляющих сахара, отсутствующие в среде культивирования бактерий, либо образование ферментов биосинтеза аминокислот, находящихся в среде культивирования в достаточном количестве). Многие же гены детерминируют синтез таких продуктов, которые нужны клетке постоянно, например ДНК– иРНК-полимераз, рибосомальных белков, молекул тРНК и рРНК и др. Подобные гены обычно экспрессируются постоянно, поэтому их называют конститутивными.
Модель оперона. Исследование механизмов регуляции генов, кодирующих утилизацию молочного сахара лактозы у E.coli, позволило Ф. Жакобу и Ж. Моно (1961) предложить модель координированного контроля работы структурных генов, известную как модель оперона. Согласно этой модели в ее нынешнем виде, транскрипция группы структурных генов, кодирующих полипептиды, тесно связанные между собой функционально, регулируется двумя контролирующими элементами – геном-регулятором и оператором. Последний представляет собой последовательность нуклеотидов, примыкающую к регулируемым структурным генам. Если продуктом гена-регулятора является белок-компрессор, его присоединение к оператору блокирует транскрипцию структурных генов, создавая стерические препятствия для присоединения РНК-полимеразы к специфичному участку-промотору, необходимому для инициации транскрипции. Напротив, если белком-регулятором служит активный апоиндуктор, его присоединение к оператору создает условия для инициации транскрипции. Оператор часто локализуется между промотором и структурными генами. Последовательность ДНК, состоящая из тесно сцепленных структурных генов, оператора и промотора, и образующая единицу генетической регуляции, называется опероном. Ген-регулятор может локализоваться рядом с опероном или на расстоянии от него. В регуляции работы оперонов участвуют также низкомолекулярные вещества– эффекторы, выступающие как индукторы либо корепрессоры структурных генов, входящих в состав оперонов.
Различают индуцируемые и репрессируемые опероны в зависимости от типа влияния на их работу молекул– эффекторов. У индуцируемых оперонов эффектор присоединяется к белку-репрессору и блокирует его связывание с оператором, препятствуя транскрипции структурных генов. Такой тип регуляции работы оперона называютнегативным. Наряду с этим, индуцируемые опероны могут находиться под позитивным контролем регуляции, при котором эффектор связывается с регуляторным белком и активизирует его активный апоиндуктор присоединяется к оператору, что обеспечивает возможность транскрипции оперона. Оба типа контроля регуляции действуют и в отношении репрессируемых оперонов. При негативном контроле эффектор, являющийся корепрессором, присоединяется к неактивному репрессору и активирует его. В результате репрессор приобретает способность присоединяться к оператору и тем самым блокировать транскрипцию оперона. При позитивном контроле функционирования репрессируемого оперона корепрессор связывается с активным апоиндуктором. Такой комплекс не может присоединяться к оператору, и структурные гены не транскрибируются.
Таким образом, при негативном контроле эффектор связывается с репрессором, что приводит к его инактивации либо активации и соответственно индуцирует, либо репрессирует транскрипцию оперона. При позитивном контроле эффектор присоединяются не к репрессору, а к апоиндуктору, что разрешает, или наоборот, блокирует транскрипцию в зависимости от того, какую форму (активную или неактивную) приобретает апоиндуктор в результате связывания с эффектором. Поскольку при транскрипции оперона, состоящего из нескольких структурных генов, образуется один общий транскрипт в виде молекулы полицистронной иРНК, все эти гены экспрессируются координированно.
Лактозный оперон E. coli. Оперон, обеспечивающий у E.coliспособность к сбраживанию молочного сахара – лактозы, состоит из промотора, оператора и трех структурных генов. Ген lac Z кодирует ферментb- генгалактозидазу, катализирующую гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы; ген lac Y-галактозидпермеазу, обеспечивающую транспорт различных сахаров, включая лактозу, мелибиозу и рафинозу, в клетку; ген lac А –тиогалактозидтрансацетилазу, роль которой обычно в утилизации лактозы не ясна. Все три белка обычно присутствуют в клетках Е.coli в следовых количествах. Однако при выращивании бактерий на среде, в которой единственным источником углерода и энергии служит лактоза, количество указанных ферментов увеличивается в 1000 раз.
Ген–регулятор лактозного (lac) оперона, обозначаемый lac 1, кодирует белок–репрессор. В активной форме это тетрамер, образованный четырьмя копиями продукта гена lac 1 – полипептидами, состоящими из 360 аминокислот. Клетки с мутациями в гене lac 1 конститутивны по синтезу ферментов, кодируемых генами lac Z, Y и A.
Конститутивный синтез продуктов этих генов возможен не только в случае lac 1 -мутаций в гене репрессоре, но и в случае мутаций в операторе, обозначаемых О. Такие мутации всегда цис–доминантны, поскольку, в отличие от гена–репрессора, оператор может влиять на возможность транскрипции структурных генов только тогда, когда он находится непосредственно рядом с промотором. Если в клетке находится индуктор, он конкурирует с оператором за молекулы репрессора, причем репрессор в первую очередь связывается с индуктором.
В качестве индукторов могут служить различные соединения. Лактоза представляет собой индуктор и одновременно субстрат. В нормальных клетках даже в отсутствие индуктора остаточная активность пермеазы и –галактозидазы обеспечивают возможность проникновения в клетку минимального количества лактозы, которая в результате реакции, катализируемой–галактозидазой, переходит в аллолактозу. Последняя связывается с репрессором, обусловливая его отсоединение от оператора, что, в свою очередь, открывает путь РНК–полимеразе для связывания с промотором и транскрипции генов lac Z, Y и A. К соединениям, являющимся только индукторами, но не субстратами, относятся изопропилb–D–тиогалактопиранозид (ИПТГ) и тиометил–b–D–галактопиранозид (ТМГ), часто используемые для исследования регуляции lac–оперона.
Мутации в промоторе в отличие от мутаций в гене–репрессоре и в операторе не влияют на индуцируемость оперона, однако они регулируют уровень его экспрессии, изменяя эффективность присоединения РНК–полимеразы, и тем самым частоту инициации транскрипции lac–оперона.
Наряду с негативной системой регуляции, lac–оперон контролируется и с помощью позитивно действующих элементов. Их обнаружение связано с исследованием феномена Ж. Моно диаусией, суть которого состоит в том, что утилизация лактозы начнется лишь после того, как будет использована вся имеющаяся в среде глюкоза. Этот феномен, как установили Б. Магазаник с соавторами, - одно из проявленийкатаболитной репрессии или глюкозного эффекта, известного еще с 40-х годов и выражающегося в неспособностиE.coli, катаболизировать различные углеводы (лактозу, арабинозу, галактозу и др.) в присутствии глюкозы, как более эффективного источника энергии.
Расшифровать механизм глюкозного эффекта сумели Р. Перлман и А. Пастан, обнаружившие, что транскрипция lac–оперона контролируется двумя элементами: небольшой молекулой–эффектором, циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ) и белком–активатором САР (от первых букв англ. Catabolite fctivator protein– белок-активатор катаболизма), называемым также белком–рецептором цАМФ. У эукариот цАМФ является медиатором действия гормонов. Оказалось, что добавление цАМФ к растущим в среде с глюкозой клеткам E.coliхотя и замедляет скорость их роста, но снимает катаболическую репрессию, обусловливая тем самым возможность экспрессии лактозного оперона в условиях одновременного присутствия в среде лактозы и глюкозы. Позднее была показана обратная зависимость между содержанием в клетке цАМФ и глюкозы: глюкоза подавляет активность фермента, синтезирующего цАМФ из АТФ. Этот фермент, названныйаденилатциклазой, кодируется геном суа.
В структуре промотора lac–оперона выявлено два сайта связывания. Один из них взаимодействует с РНК – полимеразой, другой – с комплексом САР–цАМФ. Присоединение комплекса САР–цАМФ к своему сайту на промоторе – условие индукции оперона. Следовательно, этот комплекс позитивно контролирует транскрипцию lac–оперона. Белок САР состоит из двух идентичных субъединиц с общей Моколо 45000, кодируемых геном САР, илиCRP. Мутации в генесарнарушают участок связывания белка с цАМФ, либо расширяют спектр кофакторов, объединение с которыми обеспечивает индукцию ферментов lac–оперона. У некоторых мутантов в генесартаким кофактором наряду с цАМФ может служить и цГМФ.
В норме, то есть в присутствии глюкозы и в отсутствии цАМФ, белок САР не может объединяться с промотором lac–оперона. В свою очередь, РНК–полимераза не способна эффективно связываться с этим промотором, если к нему не присоединен комплекс САР–цАМФ. Некоторые мутации в промоторе обусловливают независимость экспрессии lac – оперона от глюкозного эффекта, снижая сродство промотора к комплексу САР–цАМФ.
Таким образом, транскрипция lac–оперона на самом деле находится под двойным – негативным и позитивным– контролем. Комплекс САР–цАМФ позволяет РНК–полимеразе присоединиться к матричной ДНК до начала транскрипции. Репрессор – продукт гена lac 1–препятствует инициации синтеза иРНК.
В настоящее время расшифрована полная нуклеотидная последовательность регуляторной области lac–оперона, включающая промотор и оператор. Более того, ДЖ. Шапиро и ДЖ. Беквит с соавторами (1969) сумели выделить чистую ДНК этого оперона, включающую фрагмент гена lac1, полностью промоторную и операторную последовательности, ген lac Z, а также фрагмент гена lac Y. Выяснение структурной организации оператора lac–оперона показало, что существенную роль во взаимодействиях мультимерных белков типа lac–репрессора или РНК–полимеразы с ДНК играют симметричные структуры – палиндромы. Оператор lac–оперона состоит из 26 п.н., из которых 14 представляют собой палиндром: в различных цепях они читаются одинаково, но в противоположных направлениях. Палиндром обнаружен и в участке промотора, связывающемся с комплексом САР–цАМФ.
Триптофановый оперон E.сoli. Биосинтез аминокислоты триптофана – многостадийный процесс, в результате которого хоризмовая кислота превращается вначале в антраниловую кислоту, затем в фосфорибозилантранилат, далее в индолглицерофосфат и на следующем этапе – в триптофан. Эта цепь ферментативных реакций кодируется пятью структурными генами, образующими триптофановый (trp) оперон. Наиболее проксимально к регуляторной промотор – операторной зоне расположен ген trpE, а наиболее дистально– ген trpA. Ген trpR, кодирующий белок–репрессор, расположен на значительном удалении от trp–оперона: их разделяют 73 генетические карты E.coli. Оператор trp–оперона находится внутри промотора, содержит палиндром, образованный двумя инвертированными повторами длиной 10 п.н. Анализ полярных мутаций в левой части оперона выявил, что внутри него перед геном trpC имеется еще один промотор, обеспечивающий конститутивную экспрессию генов trpC, B и A.
Trp–оперон обладает важными особенностями, характерными и для других бактериальных оперонов, контролирующих биосинтез аминокислот. Регуляция биосинтеза триптофана осуществляется на трех уровнях. Первый из них связан с ингибированием конечным продуктом, не затрагивающим непосредственно активность генов. Суть этого феномена состоит в том, что один из продуктов биосинтетической цепи, обычно конечный, подавляет активность продуктов – предшественников. Например, при высоких концентрациях триптофана в среде фермент антранилатсинтетаза обладает значительно меньшим сродством к своим субстратам – глутаминовой и хоризмовой кислотам. Ферменты, чувствительные к такому ингибированию, часто состоят из нескольких субъединиц, одна из которых несет участок, связывающийся с субстратом, а другая – с конечным продуктом. При взаимодействии с последним фермент изменяет свою конформацию, что снижает его сродство к субстрату. Белки, способные к подобным превращениям, называютсяаллостерическими.Ингибирование конечным продуктом не следует путать с репрессией, то есть с ингибированием синтеза фермента в результате выключения транскрипции кодирующего его гена.
Второй тип регуляции биосинтеза триптофана осуществляется на уровне взаимодействия репрессора с оператором. В отличие от оперонов, определяющих утилизацию сахаров, цАМФ и белок САР не участвуют в регуляции оперонов, детерминирующих биосинтез аминокислот. Второе отличие состоит в том, что молекула–эффектор не индуцирует генную активность в результате отсоединения репрессора от оператора, а, напротив, подавляет функционирование структурных генов вследствие присоединения к оператору апорепрессора. Последний представляет собой комплекс репрессора с конечным продуктом всего биохимического пути, то есть в данном случае с триптофаном. Таким образом, триптофан обеспечивает оба уровня регуляции собственного биосинтеза. С одной стороны, он действует как аллостерический ингибитор фермента антранилатсинтетазы, а с другой – входит в состав апорепрессора, блокирующего транскрипцию оперона. При избытке триптофана в среде апорепрессор подавляет образование иРНК, что снижает уровень продукции ферментов биосинтеза триптофана примерно в 70 раз.
Казалось бы, такой двойной системы регуляции достаточно, чтобы клетка не продуцировала аминокислоту, имеющуюся в окружающей среде в достаточном количестве. Однако, секвенировав операторный и промоторный участки trp–оперона, Яновский с соавторами обнаружили еще один механизм регуляции его работы. Оказалось, что каждая иРНК, образующая при транскрипции trp–оперона, имеет район, списываемый с последовательности ДНК, лежащей между оператором и триплетом, кодирующим стартовый кодон АУГ, с которого инициируется трансляция полицистронной иРНК. Эта последовательность, состоящая из 162 п.н., называется лидирующей. При сравнении влияния различных делеций в trp–опероне на его транскрипцию установлено, что последовательность длиной 30–60 нуклеотидов, примыкающая к гену trpE, является контролирующим элементом - аттенюатором. Подобный элемент, как уже говорилось, участвует в регуляции и his–оперона. Аттенюатор терминирует транскрипцию иРНК, начавшуюся от промотора. В результате образуется короткая иРНК, комплементарная первым 130 нуклеотидам лидирующей последовательности. Прекращение транскрипции в сайте–аттенюаторе не обязательно и зависит от количества триптофана в клетке. При росте клеток в среде с избытком триптофана из каждых десяти молекул РНК–полимеразы лишь одна преодолевает аттенюаторный барьер и начинает транскрипцию структурных генов. В случае недостатка экзогенного триптофана число молекул РНК–полимеразы, прошедшие аттенюатор, существенно увеличивается. 42 из 162 кодонов лидирующей последовательности детерминируют трансляцию пептида из 14 аминокислот. Лидерный пептид регулирует взаимодействие молекул триптофановых тРНК с иРНК на рибосомах. Аттенюаторы обнаружены в различных оперонах и у различных бактерий. Особенность их структуры – наличие палиндрома, ведущего к образованию терминирующей шпильки в иРНК. Сочетание механизмов супрессии и аттенюации обеспечивает более эффективную и адекватную условиям внешней среды регуляцию генной активности.
Особенности генетической регуляции у высших эукариот. Важнейшая особенность функционально–генетической организации эукариот – отсутствие у них оперонов, подобным оперонам бактерий. У высших эукариот гены, кодирующие ферменты, катализирующие последовательные этапы биосинтеза какого–либо метаболита, могут находиться в разных участках одной хромосомы или даже в разных хромосомах. Тем не менее, и физико–химический, и прямой визуальный анализы вновь синтезированной РНК с помощью электронного микроскопа показывают, что очень часто она состоит из нескольких десятков тысяч нуклеотидов. Поэтому правильнее говорить о функциональной генетической единице у эукариот как о транскриптоне (Г. П. Георгиев), то есть участке ДНК, с которого считывается единая непрерывная молекула РНК.
Тем не менее, координация работы генов, детерминирующих какие–либо функции клетки, убедительно показана на ряде примеров. Так, введение в организм животного гидрокортизона или фенобарбитала, являющихся индукторами– дерепрессорами генома клеток печени, активирует группу генов, среди которых находятся как гены, кодирующие определенные белки, так и гены рРНК и тРНК. Иными словами, в ответ на действие указанных индукторов активизируется целая батарея генов. Предполагается, что существование гомологичных повторов способствует тому, что сигналы индукции служат как бы «ключами», отпирающими один и тот же «замок» в различных генах одной батареи. Это может означать, что один и тот же белок–репрессор связан с гомологичными повторами в каждом члене одной генной батареи.
Фактов, указывающих на существование системы генетической регуляции в клетках высших растений и животных, немало. Следует, однако, заметить, что эти факты, в частности, обнаружение последовательностей типа «ящика Хогнесса», позволяют судить только о некоторых деталях регуляции, касающихся отдельных генов. Общая картина механизма генетической регуляции в эукариотических клетках пока неясна, однако сам факт тотальной регуляции действия генов сомнений не вызывает. Наиболее объективно он может быть оценен по числу типов генных продуктов (РНК–вых копий) в цитоплазме. Этот вопрос был исследован на клетках человека линии HeLa, более 30 лет культивируемых in vitro. Геном клеток HeLa считается сильно депрессированным, то есть в них функционирует значительно большее (около 35 тысяч) число генов, чем в обычных соматических клетках, хотя это не означает, что клетки HeLa производят столь же большое количество конечных генных продуктов– полипептидов. Оказалось, что по функциональной активности гены клеток HeLa могут различаться почти на 4 порядка. Так, существует около 12–13 тысяч РНК–вых копий, и несколько десятков генов, которым в цитоплазме соответствуют единичные молекулы иРНК.
Со времени открытия повторяющихся нуклеотидных последовательностей в эухроматической части генома многие авторы пытались обосновать их возможную роль в регуляции биохимических процессов у эукариот. Так, Р. Бриттен и Э. Дэвидсон (1979) обратили внимание на то, что первичные транскрипты имеют в своем составе повторяющиеся последовательности и, следовательно, их можно рассматривать как копии интерсперсной части ген