Методы окраски микроорганизмов.
Простая окраска.
Способы окрашивания микробов делятся на простые и сложные, или дифференциальные.
Простая окраска позволет быстро и хорошо ознакомиться с общей морфологией микробов, ввиду чего этот способ применяется в лабораториях наиболее часто.
При простой окраске обычно употребляется только одна краска, чаще всего красная—фуксин, или синяя – метиленовая синяя.
Фуксин красит более(1-2 минуты), интенсивнее и окрашивает одинаково все виды бактерий.
Синяя красит медленнее (3-5 минут), менее ярко, но препараты получаются более ясными. Кроме того, она даёт окраску различной интенсивности у разных видов бактерий.
Сложные методы окраски бактерий.
Сложные, или дифференцированные, способы окраски бактерий основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Он применяются для длительного изучения структуры клетки, а также для характеристики и дифференциации данного микроба от других. Таким образом, сложные способы окраски микробов являются необходимым диагностическим методом в микробиологической практике. Наибольшее практическое значение имеет окраска по Граму и по Цилю-Нильсену.
Окраска по Граму.
Метод окраски по Граму является самым универсальным из сложных способов окраски. Все бактерии по своему отношению к этому методу разделяются на две группы: красящиеся по Граму – грамположительные, грампозитивные и не красящиеся – грамотрицательные, грамнегативные. Отношение к окраске по Граму является настолько важным опознавательным признаком бактерии, что обязательно упоминается в их характеристике.
Сущность этого метода состоит в том, что краска трифенилметанового ряда, например, генцианвиолет, и йод образуют в протоплазме бактериальной клетки соединение, которое прочно удерживается некоторыми бактериями при обесцвечивании их спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет (грамположительные бактерии). Другие же обладают свойством удерживать краску, и при обработке обесцвечиваются (грамотрицательные микробы).
Различное отношение к окраске по Граму зависит от разницы в физико-химическом составе микробных клеток.
Техника окраски по Граму
1.На фиксированный мазок кладут небольшой кусок фильтровальной бумаги и наливают раствор генциан-виолета. Через 2 минуты полоску фильтровальной бумаги удаляют. Сливают краску.
2.Не промывая препарат водой, наносят раствор Люголя на 1 минуту.(Мазок чернеет). Затем раствор Люголя сливают.
3.Препарат обесцвечивают спиртом, наливая его на мазок на 20-30 секунд. Препарат необходимо покачивать и сменять спирт, или погружают мазок в стаканчик со спиртом 2-3 раза (до отхождения фиолетовых струек краски).
4.Препарат промывают водой.
5.Окрашивают водным раствором фуксина в течении 1- 2 минут.Сливают краску,промывают водой.
7.Высушивают фильтровальной бумагой, исследуют с иммерсионной системой.
Удобной модификацией является способ Синева, при котором пользуются заранее приготовленными полосками фильтровальной бумаги, пропитанной краской генциан-виолет и затем высушенной. Эти полоски кладут на фиксированный мазок, на который предварительно наносят 2-3 капли воды. В остальном техника аналогична оригинальному способу Грама.
Грамположительные микробы Гр(+) при окраске генцианвиолетом приобретают тёмный сине-фиолетовый цвет
Грамотрицательные Гр(-) окрашиваются дополнительно фуксином в красный цвет
Чтобы получить правильную окраску, рекомендуется употреблять для окраски по Граму свежие (суточные) культуры микробов. Окраска старых культур даёт непостоянные результаты.
Отношение различных видов бактерий к способу окраски по Граму:
Все патогенные кокки (шаровидные) являются грамположительными Гр(+)
Исключение гоноккок и менингококк – Грамотрицательные ГР(-)
Извитые формы микробов (вибрионы,спирохеты) –Грам отрицательные Гр(-)
Палочковидные бывают грамположительные и грамотрицательные Гр(+),Гр(-)
Спорогенные бациллы в большинстве грамположительные Гр(+)
Прижизненная окраска микробов.
Прижизненной(витальной) окраской называется такая, при которой клетки микробов прокрашиваются в живом состоянии.
Для прижизненной окраски микробов применяют наименее ядовитые краски(мителеновая синяя, нейтральная красная, везувин) в малых концентрациях (от 0,1% до 0,001%).
Одним из простых способов является следующий: на чистое предметное стекло наливают насыщенный водный раствор мителеновой синей, дают ему высохнуть и затем чистой сухой ветошью(или фильтрованной бумагой) протирают стекло, пока налёт краски на нём не примет светло-голубого оттенка. Затем на стекло наносят каплю исследуемого материала и накрывают её покровным стеклом. При микроскопировании можно видеть, как микробы постепенно окрашиваются в голубой цвет, оставаясь живыми (например, не теряя своей подвижности).
Можно воспользоваться более грубым способом: каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с краской (0,1%-0,01 %), накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом.