Контроль качества средства проводится по данным параметрам
7.1. Определение внешнего вида.
Внешний вид и цвет средства определяют визуальным осмотром пробы.
7.2. Измерение массовой доли бродифакума.
Методика измерения массовой доли бродифакума в средстве основана на методе обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектированием, хроматографированием раствора пробы в изократическом режиме после экстракционной очистки, количественная оценка методом внутреннего стандарта.
Средства измерения, оборудование
- аналитический жидкостной хроматограф, снабженный УФ-детектором (254 нм), изократическим насосом, инжектором с объемом дозы 10 мкл, интегратором или компьютерной системой обработки хроматографических данных;
- хроматографическая колонка длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная сорбентом Зорбакс ODS 5 мкм, или другая с аналогичной разрешающей способностью;
- весы лабораторные общего назначения 2 класса, по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г;
- цилиндр 100 см3;
- колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2 ГОСТ 1770;
- пипетки 1-2-2-10 ГОСТ 29228;
- бродифакум – аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 99,4% (импорт, фирма "Лифа", Франция) или технический продукт с точно установленным содержанием действующего вещества;
- 1,3,5-трифенилбензол – ("ч") внутренний стандарт, МРТУ 6-09-4580-67;
- метиловый спирт (метанол) градации для жидкостной хроматографии;
- кислота муравьиная – "ч.д.а", ГОСТ 5848;
- кислота уксусная ледяная – "ч.д.а.", ГОСТ 61-75;
- вода очистки на оборудовании "Миллипор" или бидистиллированная;
- гелий газообразный по ТУ 51-940-80 марки Б, сжатый в баллоне;
- делительная воронка ВД-3-250 ХС; ВД-2500 ХС ГОСТ 25336;
- ротационный испаритель ИР-1 М, ТУ 25-11-917-76 или аналогичный;
Допускается использовать импортную посуду и реактивы, обеспечивающие точность измерений.
7.2.2. Подготовка к выполнению измерений.
Подготовка хроматографа.
Приготавливают подвижную фазу (элюент): в цилиндре вместимостью 100 см3 смешивают метанол (94,2 см3), воду (5 см3) и ледяную уксусную кислоту (0,8 см3), раствор дегазируют потоком гелия в течение 5-7 минут или другим известным способом.
Устанавливают хроматографическую колонку в термостат и, прокачивая подвижную фазу, проверяют герметичность системы. Кондиционируют колонку до получения стабильной нулевой линии.
Условия работы хроматографа:
- длина волны 254 нм;
- объемная скорость подвижной фазы 1 см3/мин.;
- объем вводимой пробы 10 мкл;
- чувствительность устанавливают такую, чтобы высота хроматографических пиков составляла 60-80% полной шкалы.
Примерное время удерживания бродифакума 6,2 мин., 1.3.5.-трифенил-бензола 11,7 мин.
Условия выполнения измерений подлежат проверке и при необходимости корректировке.
7.2.3. Приготовление раствора для разбавления и раствора для экстрагирования.
- Раствор для разбавления:
в цилиндре вместимостью 100 см3 смешивают 60 см3 метилового спирта и 40 см3 хлористого метилена.
- Раствор для экстрагирования (экстрагент) – хлористый метилен, насыщенный муравьиной кислотой:
в делительной воронке тщательно смешивают 1000 см3 хлористого метилена и 55 см3 муравьиной кислоты, после расслоения фаз в течение 1-2 минут сливают и отбрасывают мутный слой и добавляют еще 80 см3 хлористого метилена.
7.2.4. Приготовление градуировочных растворов
- Градуировочный раствор внутреннего стандарта: в мерной колбе вместимостью 250 см3 растворяют в 100 см3 хлористого метилена, 0,05 г 1,3,5-трифенилбензола, добавляют объем раствора до метки метиловым спиртом и перемешивают.
- Основной градуировочный раствор бродифакума:
в мерной колбе вместимостью 50 см3 растворяют в 20 см3 хлористого метилена, 0,05 г бродифакума, добавляют объем раствора до метки метиловым спиртом и перемешивают.
- Рабочий градуировочный раствор с внутренним стандартом:
дозируют в мерную колбу вместимостью 50 см3 по 10 см3 основного градуировочного раствора бродифакума и градуировочного раствора внутреннего стандарта и добавляют объем раствора до метки раствором для разбавления.
Рабочий градуировочный раствор с внутренним стандартом хроматографируют не менее четырех раз до получения стабильной площади хроматографических пиков бродифакума и внутреннего стандарта. Из полученных хроматограмм вычисляют значение относительного градуировочного коэффициента бродифакума по 1,3,5-трифенилбензолу.
Градуировочные растворы бродифакума используются свежеприготовленными и не могут сохраняться более одних суток.
7.3. Выполнение измерений.
В делительную воронку вместимостью 250 см3 помещают 3 г средства, добавляют 50 см3 водного раствора гидроксида натрия и тщательно перемешивают, добавляют 10 см3 метилового спирта и вновь перемешивают. Экстрагируют раствор 20 см3 хлористого метилена и отстоявшийся слой сливают в круглодонную колбу. Экстракцию повторяют еще тремя порциями хлористого метилена. Из объединенного экстракта отгоняют растворитель на ротационном испарителе при температуре 50оС. Охлажденный до комнатной температуры осадок растворяют в 10 см3 раствора внутреннего стандарта и добавляют 40 см3 раствора для разбавления. Смешивают 10 см3 полученного раствора с 50 см3 раствора для разбавления и хроматографируют.
Рекомендуется следующий порядок введения проб: в хроматограф вводят последовательно четыре аликвоты градуировочного раствора, затем две аликвоты раствора испытуемого образца средства.
Из полученных хроматограмм вычисляют массовую долю бродифакума в испытуемом образце средства.
7.4. Обработка результатов измерений.
7.4.1. Вычисление относительного градуировочного коэффициента.
Из каждой хроматограммы градуировочного раствора с внутренним стандартом вычисляют относительный градуировочный коэффициент Кi по формуле:
где: SДВ (Sвн.ст.) - площадь (или высота) хроматографического пика бродифакума (1,3,5-трифенилбензола), мм2;
Мдв (Мвн.ст.) – масса бродифакума (1,3,5-трифенилбензола), внесенного в градуировочный раствор, мг;
а – массовая доля бродифакума в аналитическом стандарте.
Вычисляют среднее значение относительного градуировочного коэффициента К.
7.4.2. Вычисление массовой доли бродифакума в средстве.
Массовую долю бродифакума в средстве вычисляют по формуле:
где:
S i (S вн.ст.) – площадь хроматографического пика бродифакума (1,3,5-трифенилбензола) в i–м растворе испытуемого образца;
mпр. (m вн.ст.) – масса пробы образца (1,3,5-трифенилбензола) в испытуемом растворе, г;
К – установленное значение относительного градуировочного коэффициента.
За результат измерений принимают среднее арифметическое двух параллельных измерений, абсолютное расхождение между которыми не превышает допускаемое, равное 0,003%, границы интервала допустимой абсолютной суммарной погрешности результата измерений ±0,002% при доверительной вероятности 0,95.