Предварительный дизайн праймеров вручную.
Есть программы и сервисы, позволяющие автоматически подбирать последовательности праймеров. Это удобно, но недостаток в том, что могут не учитываться особенности матрицы (см. ниже) или же могут быть пропущены вполне хорошие праймеры, в результате чего программа ничего не выдаст. Вначале можно попробовать подобрать праймеры вручную, воспользовавшись следующими правилами:
- Длина праймера примерно 25 нт
- В праймере отсутствуют большие повторы AT и GC (более 6-7)
- Избегать на 3'-конце праймера три GC пары, если они есть после них обязательно должны быть 2 АТ-пары, после двух GC пар – 1 AT пара
- 3'- и 5'- концы праймера не должны быть комплементарными (длина комплементарного участка не должна превышать 3 нуклеотидов)
- Как правило, очень хорошие праймеры содержат длинные участки чередующихся CT или GA пар.
- Если один праймер обогащен С или T, тогда другой не должен быть сильно обогащен G или А соответственно.
- Избегать большого количества GT и TG динуклеотидов.
- Количество GC-пар составляет примерно половину от всей длины праймера
- Расстояние между праймерами не менее 70 п.н. и не более 200 п.н.
Более тщательный анализ подобранных праймеров и свойств матрицы.
Выше указанные правила не гарантируют подбор качественных праймеров, однако позволяют увидеть значительно больше вариантов, нежели в некоторых программах подбора праймеров. Дальнейший анализ качества праймеров проводится программно.
При помощи доступного и качественного программного обеспечения (например, программы Vector NTI) необходимо узнать:
- 1. Могут ли праймеры отжигаться сами на себя и друг на друга, т.е. какова энергия образования праймер-димеров, она не должна быть сильно отрицательной (< -1 кКал) в условиях проведения ПЦР (концентрация солей, ионов магния, температура отжига праймеров). Если энергия < -1 кКал, тогда посмотреть какие участки дают наибольший вклад и сдвинуть положение праймера в амплифицируемой мишени. Если сдвиг нарушает правила подбора праймера или также способствует образованию димеров праймеров, то необходимо изменить положение праймера (одного или обоих) внутри выбранной мишени, или же выбрать другую мишень.
- 2. Образует ли ДНК матрица в местах отжига праймеров шпилечные или иные структуры при температуре отжига праймеров. Если есть сильные структуры (с длиной стебля больше 4-5 п.н.), то необходимо изменить положение праймера, т.к. эти структуры образуются быстрее и мешают отжигу праймеров вплоть до полного блокирования. Шпилечные структуры можно определить в программе DNAfold, свободно доступной на сайте https://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/dna-folding-form.
Критические параметры программы:
Folding temperature (between 0° and 100° C) – ввести температуру отжига праймеров (например, 60)
Ионные условия должны выглядеть примерно, так – это самые стандартные условия
· Ionic conditions: [Na+] [Mg++]
Units: M mM Correction type: Oligomer Polymer
Можете уточнить каково содержание ионов магния и натрия по составу буфера для ПЦР.
Главное выбрать Units в mM.
Если длина амплифицируемого участка (вместе с праймерами) не превышает 800 анализ будет сделан он-лайн, если больше, необходимо указать e-mail адрес на который придет ссылка с результатами.
Нажать кнопку «Fold DNA » для запуска анализа.
Через некоторое время окно обновится, и будут показаны результаты, которые можно скачать в разных форматах. В полученных результатах определите положение стебельков шпилек на вашей матрице, выделите эти участки и избегайте их при дизайне праймеров.
Удобно это делать в программе Vector NTI. Эта же программа позволяет рассчитать различные характеристики праймеров, такие как температура отжига, GC-состав и прочие.
5. Анализ праймеров на специфичность в геноме. Выполняется в он-лайн сервисе NCBI под названием Primer-BLAST. Сервис свободно доступен по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Чтобы анализировать специфичность уже готовых праймеров необходимо заполнять поля Primer Parameters. Настройки интуитивно понятны, ввести последовательности праймеров, задать максимальную длину интронов, которые еще могли бы быть амплифицированы в условиях ПЦР (не более 1.5 при времени элонгации 20 сек), указать организм и базу данных (Database, лучше использовать референсный геном выбранного объекта)
Дизайн TaqMan зондов.
1. Температура отжига зонда на 5-10С выше, чем праймеров. Это необходимо для того, чтобы зонд отжегся на матрицу раньше, чем началась собственно полимеразная реакция. Если реакция начнется раньше, то зонд вообще не отожгется на двуцепочечный участок.
2. Длина зонда 15-30 нуклеотидов.
3. Желательно расположить зонд на границе экзонов, т.е. одна его часть лежит в одном экзоне, другая – соседнем. Это обеспечивает специфичность детекции именно кДНК, а не геномной ДНК.
4. Гаситель флуоресценции лучше расположить внутри праймера через 10 нуклеотидов от флуоресцентной метки.
5. На 5'-конце, куда навешивается флуоресцентная метка не должно быть G, гуанин гасит флуоресценцию некоторых красителей, особенно из семейства флуоресцеинов. Лучше, чтобы это был C или T.
6. Должно быть как можно меньше G в участке зонда между флуоресцентной меткой и гасителем флуресценции. Если на одной цепи много G, тогда делайте дизайн зонда к комплементарной цепи.
Taq-man зонд также можно проверить на способность образовывать праймер-димеры самим с собой и с другими праймерами, используемыми в ПЦР. Также необходимо определить не отжигается ли зонд на какую-либо сильную вторичную структуру матрицы.
Автоматический подбор последовательностей Taq-man зондов
Список программ и сервисов для автоматического дизайна Taq-man зондов.
https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer
https://www.premierbiosoft.com/tech_notes/TaqMan.html
Также смотрите прилагаемые файлы.pdf. где-то в них даются списки сайтов для автоматического дизайна Taq-man зондов и праймеров для ПЦР.
Еще вариант – поиск статьей, где сделан анализ экспрессии интересующих Вас генов при помощи ПЦР реальном времени и с зондами Taq-man. В таких статьях могут быть указаны готовые праймеры и раз люди получили результаты – они работают.
Для поиска можно использовать Google: ввести название гена и Taq-man или название гена и real-time PCR. Или в базе данных научной литературы NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed введя в поисковую строку теже термины, что и для Google.
Есть также базы данных по праймерам для ПЦР в реальном времени. В этих базах собраны работающие праймеры, можно посмотреть нет ли там праймеров на нужные гены и вдобавок к ним сделать дизайн Taq-man зондов.
Успехов!