Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплексных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины-gр120, gр 41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.
Реакция проводится в несколько этапов:
1. Вирус разрушают на компоненты - антигены (р24, gр120, gр 41 и др.), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.
2. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.
3. Стрипы с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем о и затем о
новой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают.
5. Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют в зоне локализации комплекса АГ-АТ.
Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ. Результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ — р24, gp41 и gp 120
2) Серодиагностика инфекционных заболеваний. Динамика образования антител, первичный и вторичный иммунный ответ. Отличие истинной от анамнестической реакции иммунитета. Диагностическая ценность определения нарастания титра антител и определенных классов иммуноглобулинов.
Особенности взаимодействия антитела (АТ) с антигеном (АГ) являются основой диагностических реакций (или серологических от лат. serum – сыворотка), поскольку один из компонентов всегда известен. Используют для:
1) Серодиагностика – это обнаружение в исследуемой сыворотке АТ против АГ возбудителя, позволяющее поставить диагноз, судить о напряженности постинфекционного иммунитета. Проводят с помощью набора специфических АГ – диагностикумов. Они позволяют установить наличие АТ в материале (чаще всего сыворотке больного).
2) Сероидентификаци я проводится для определения вида и серовара выделенных культур микроорганизмов (АГ) с помощью набора специфических антисывороток – диагностических сывороток (содержат АТ).
I. Реакции, протекающие с укрупнением частиц антигена в растворе электролита:
1. Реакции агглютинации От лат. agglutinacion – склеивание. Проявляется всклеивании и выпадении в осадок корпускулярныхантигенов (бактерий, эритроцитов), а также частиц садсорбированными на них антигенами под влияниемантител в среде с электролитом. Реакция протекает в2 фазы:
1 – специфическая адсорбция АТ на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие АГ;
2 – образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок. Происходит в присутствии электролита (раствор NaCl).
Механизм реакции описывается теорией «решётки», согласно которой агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного АТ с эпитопом одного АГ, а второго активного центра – с эпитопом другого АГ. Избыток или недостаток антител препятствует проявлению агглютинации.
Ориентировочная реакция агглютинации. Для обнаружения антигенов: на одну полову стеклананосят каплю диагностической сыворотки, на другую– каплю изотонического раствора хлорида натрия.Петлей в каждую каплю вносят небольшое количествобактериальной культуры и перемешивают дополучения равномерной взвеси. Учет производят через3-5 минут. В положительном случае, при образованиикомплекса АГ-АТ, образуются хлопья. Капля сфизиологическим раствором должна оставатьсямутной.Для обнаружения антител: в каплю исследуемойсыворотки больного добавляют диагностикум.Результат оценивают по образованию хлопьевидногоосадка. В качестве контроля используютфизиологический раствор.
Развернутая реакция агглютинации. Для обнаружения антител в сыворотке.Делают разведения сыворотки больного (титрование).Затем в каждую пробирку добавляют диагностикум –взвесь убитых микробов, к которым ищут АТ. Такжеиспользуют два контроля: контроль сыворотки иконтроль диагностикума. После инкубации учитываютрезультаты. Положительный – выпадение осадка ипросветление среды. Определяют титр АТ всыворотке: учитываютмаксимальноеразведение (титр)с положительнымрезультатом.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) В случаях, когда АГ высоко дисперсны и комплексАГ-АТ не виден, их адсорбируют на более крупныхчастицах-носителях, например, эритроцитах(латексные частицы и др.) и используют в качестведиагностикума для определения АТ в сывороткебольного.В положительном случае АТ исследуемойсыворотки связываются с АГ, адсорбированнымина эритроцитах, что вызывает склеивание ивыпадение их в осадок на дно пробирки в виде«зонтика» (фестончатый осадок с неровнымикраями).При отрицательной реакции эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки» (маленький компактный осадок).Титр сыворотки в РНГА – это максимальное разведение сыворотки, которое дает положительный результат
