ТЕМА: Стерилизация, асептика, антисептика, дезинфекция.
Принципы, методы культивирования микроорганизмов и выделения чистых культур.
Бактериологический метод исследования. 1 этап.
Цель:
1. Ознакомиться с основными методами дезинфекции и стерилизации, применяемыми в микробиологии и медицине.
2. Знать особенности метаболизма микроорганизмов, принципы их культивирования в лабораторных условиях.
3. Освоить 1 этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.
Знать:
1. Методы, приборы и режимы стерилизации питательных сред, лабораторной посуды, медицинского инструментария.
2. Основные группы дезинфектантов, механизм их действия, область и способ применения.
3. Назначение питательных сред в микробиологической практике.
4. Принцип получения чистых культур микроорганизмов и сущность бактериологического метода, как «золотого стандарта» в диагностике инфекционных заболеваний.
5. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения чистых культур микроорганизмов.
Уметь:
1. Выбрать средства, режим стерилизации и дезинфекции в соответствии с конкретными задачами.
2. Охарактеризовать предложенные питательные среды, применяемые в микробиологической практике.
3. Провести 1 этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.
Контрольные вопросы:
1. Бактериостатическое и бактерицидное действие низких и высоких температур на микроорганизмы.
2. Влияние химических веществ различных классов на микроорганизмы. Антисептики и дезинфектанты.
3. Понятия: стерилизация, дезинфекция, асептика, антисептика.
4. Методы, аппаратура и режимы стерилизации, их выбор в зависимости от свойств стерилизуемого объекта.
5. Основные группы дезинфектантов и тактика их применения в ЛПУ.
6. Принципы и методы культивирования микроорганизмов.
7. Питательные среды: понятие; требования, предъявляемые к ним; классификация.
8. Понятие о виде, штамме, колонии, чистой культуре микроорганизмов.
9. Сущность бактериологического метода и области его применения.
10. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Ознакомиться с приборами, используемыми для стерилизации в медицинской и микробиологической практике: паровой стерилизатор (автоклав), печь Пастера.
2. Выбрать приборы и режимы стерилизации питательных сред, лабораторной посуды, медицинского инструментария.
3. Ознакомиться с дезинфектантами, используемыми в медицинской и микробиологической практике. Выбрать дезинфектанты и режим дезинфекции для предлагаемых объектов.
4. Ознакомиться с различными питательными средами, применяемыми в микробиологической практике, дать их характеристику по составу, консистенции, назначению.
5. Провести 1 этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробов:
5.1. Приготовить фиксированный препарат из исследуемого материала, окрасить по Граму, промикроскопировать и провести идентификацию выявленных микроорганизмов по морфологическим и тинкториальным свойствам.
5.2. Посеять исследуемый материал методом «штрих с площадкой».
5.3. Посеять исследуемый материал методом Дригальского (демонстрация).
6. Ознакомиться с набором средств для взятия и транспортировки патологических материалов.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
1. Знакомство с приборами, используемыми для стерилизации: паровой стерилизатор (автоклав), печь Пастера.
1.1. Паровой стерилизатор (автоклав) - стерилизация паром под давлением.
Наиболее надежным и универсальным методом стерилизации в медицинской и микробиологической практике является стерилизация паром под давлением. Производят ее в автоклаве, в котором стерилизуемые объекты нагревают насыщенным паром под давлением выше атмосферного. Между показаниями манометра и температурой насыщенного пара имеется следующая зависимость:
| Давление (атм) | Температура (° С) |
| 0,0 | |
| 0,5 | |
| 1,0 | |
| 1,5 | |
| 2,0 |
Нулевым давлением считают нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.).
Стерилизация достигается только при полной исправности автоклава и правильной его эксплуатации специально обученным персоналом. Поэтому необходим постоянный контроль за режимом стерилизации, который производится физическим (термометр максимальный и др.), биологическим (биотест со спорами тест-культур микроорганизмов) и химическим (химические тесты, индикаторы типа ИС) способами.
Контроль режима стерилизации автоклавов проводят химическим способом при каждой загрузке автоклава. Химический тест – стеклянная трубочка с химическим веществом, имеющим определенную температуру плавления: антипирин, резорцин - 110±1°, бензойная кислота - 120±2°, бензамид - 126±1°, мочевина, никотинамид, Д (+)-манноза - 132±2°. В состав химических тестов вводят анилиновый краситель (фуксин, генцианвиолет и др.), который равномерно окрашивает вещество при его расплавлении. В настоящее время чаще используются индикаторы типа ИС (фирма «Винар», Россия), представляющие полоску бумаги с нанесенным на нее слоем индикаторной смеси и предназначенные для оперативного визуального контроля не только температуры, но и времени стерилизации (ИС-120, ИС-132). Ежеквартально проводится контроль режима стерилизации с использованием биотеста со спорами тест-культуры Bacillus stearotermophilus BKM B-718.
1.2. Печь Пастера – стерилизация сухим жаром.
В печи Пастера стерилизуют изделия из стекла, металлов и резин на основе силиконового каучука. Режим стерилизации: 160°С – 150 мин; 180°С – 60 мин. Контроль режима стерилизации при каждом цикле осуществляется с помощью индикаторов стерилизации ИС-160, ИС-180; ежеквартально - с использованием биотеста со спорами тест-культуры Bacillus licheniformis шт. G BKM B-1711 Д.
2. Заполнить дома таблицу №1.
Таблица 1.
Стерилизация
| № пп | Объект | Приборы | Режим |
| 1. | Питательные среды: - МПА; - Гисса | ||
| 2. | Лабораторная посуда | ||
| 3. | Шприцы (пометка 200°) | ||
| 4. | Хирургические, гинекологические, инструменты из коррозионностойких металлов | ||
| 5. | Перевязочный и шовный материал, хирургическое белье | ||
| 6. | Перчатки |
3. Ознакомиться с дезинфектантами и заполнить на занятии таблицу №2, используя приложения №1, 2.
Таблица 2.
Дезинфекция
| № пп | Объект | Дезинфектант | Режим дезинфекции | Способ обработки | |
| Концентрация р-ра, % | Время (мин) | ||||
| 1. | Рабочий стол | ||||
| 2. | Халаты, шапочки | ||||
| 3. | Мазки | ||||
| 4. | Руки | ||||
| 5. | Фонендоскоп |
4. Ознакомиться с питательными средами и заполнить на занятии таблицу №3 «Питательные среды».
Таблица 3.
| № пп | Название питательной среды | Классификация | ||
| по составу | по консистенции | по назначению | ||
| 1. | ||||
| 2. | ||||
| 3. | ||||
| 4. | ||||
| 5. |
5. Клиническая микробиология как раздел медицинской микробиологии решает две основные задачи: этиологическую диагностику инфекционного заболевания и рациональный выбор средств этиотропной терапии.
Основным методом микробиологической диагностики, позволяющим решить эти задачи, является бактериологический метод. Суть бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя, определение его вида и чувствительности к антимикробным препаратам.
Выбор исследуемого материала зависит от вида заболевания и преимущественной локализации возбудителя на определенном этапе его развития (патогенеза). Материалом может служить кровь, ликвор, раневое отделяемое, мокрота, испражнения, моча и т. д. Техника забора материала имеет большое значение в получении достоверного результата.
Успех выделения чистой культуры определяется правильностью выбора питательной среды и условий культивирования. Универсальной питательной среды, использование которой позволит выделить любые микроорганизмы из любого исследуемого материала, не существует. Поэтому с учетом физиологических особенностей возможных возбудителей заболевания производится посев материала на определенную питательную среду или комплекс питательных сред (специальные, элективные, дифференциально-диагностические). Для некоторых микроорганизмов требуются и особые условия культивирования (анаэробные, микроаэрофильные, с повышенным содержанием углекислоты).
Патологический материал от больного часто представляет смесь микроорганизмов. В этой связи задачей является их разобщение и получение изолированных колоний. Изолированная колония, как результат размножения одной микробной клетки и состоящая из одного вида клеток, является основой для получения чистой культуры. В микробиологической практике используют различные методы получения изолированных колоний. Наиболее чаще используются следующие:
1. Посев исследуемого материала методом «штрих с площадкой» – исследуемый материал наносят на поверхность плотной питательной среды на ограниченном участке, а затем распределяют путем посева частыми параллельными штрихами.
2. Метод Дригальского – материал, внесенный на первую чашку с питательной средой и посеянный с помощью шпателя, последовательно засевают тем же шпателем, не стерилизуя его, еще на 1-2 чашки.
3. Метод секторных посевов – исследуемый материал одной петлей засевают последовательно на несколько секторов. При этом определенная техника посева (метод Gould) позволяет не только получить изолированные колонии, но и определить количество микроорганизмов в 1 мл (г) исследуемого материала, что имеет значение при оценке этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов (УПМ).
5.1.Проведение 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов:
· из исследуемого материала приготовьте фиксированный препарат, окрасьте по методу Грама, промикроскопируйте, проведите идентификацию обнаруженных микроорганизмов по морфо-тинкториальным свойствам; обратите внимание на количество микроорганизмов. Результаты занесите в протокол и сделайте вывод;
· посейте исследуемый материал на половину чашки с плотной питательной средой методом «штрих с площадкой»;
· посейте исследуемый материал на три чашки с питательными средами методом Дригальского (демонстрация);
· подпишите чашки, указав дату посева, и поставьте их вверх дном в термостат при температуре 37° на 18-24 ч.
6. Средства для взятия и доставки патологического материала
| № пп | Средства | Патологический материал |
| 1. | Шприцы | Кровь, гной, экссудаты |
| 2. | Стерильные ватные тампоны | Отделяемое из ран, мазки со слизистых оболочек, из глаза, уха, носа, зева, цервикального канала, влагалища |
| 3. | Контейнеры, лабораторная посуда | Мокрота, моча, кал |
| 4. | Транспортные среды* | Для различного патологического материала |
Примечание:* - используют в случае, если сроки доставки материала в лабораторию после его получения превышают 1,5-2 ч.
Вопросы для самоконтроля:
1. Назовите и обоснуйте принципы культивирования микроорганизмов.
2. Почему при посеве патологического материала используются элективные, дифференциально-диагностические среды и среды накопления.
3. Обоснуйте принцип получения чистых культур микроорганизмов.
4. Почему бактериологический метод является «золотым стандартом» в микробиологической диагностике инфекционных заболеваний?
5. На чем основаны химические и биологические способы получения чистых культур микроорганизмов?
6. В чем состоит отличие стерилизации от дезинфекции?
7. Обоснуйте назначение стерилизации и дезинфекции в микробиологической и медицинской практике.
8. Обоснуйте преимущество использования термоиндикаторных систем при контроле режима стерилизации (на примере индикатора ИС фирмы «Винар», Россия).
Литература:
Учебники:
1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 26-29, 63-66, 150-159.
2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 76-77, 126-130, 253-265.
Дополнительная литература:
1. Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности и гельминтами: Санитарные правила. – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 1999. – 107с.
Лекции по микробиологии.
Тесты.
Приложение 1