Повышенная скорость/эффективность накопления оксигемоглобина в эритроцитах, ассоциируемая с SARS CoV 2

Протокол сортировки проб крови по изменению цвета на алый.

1. Для анализа следует использовать кровь людей с сатурацией не ниже 93. Если сразу при взятии или контакте с кислородом воздуха, кровь имеет светло-алый цвет, то такая кровь непригодна для дальнейшей оценки (рекомендую проверить наличие метаболического алкалоза, аммиака в крови у таких людей). Если сатурация низкая и есть признаки метаболического ацидоза, повышенный уровень молочной кислоты в крови, то такая кровь тоже не пригодна для исследований, по причине низкой рН и слишком медленного изменения цвета.

2. Данная оценка необходима для выявления людей без признаков ORDS и тяжелых поражений легких, тем не менее, подозреваемых на вирусоносительство или наличие стертых, атипичных симптомов COVID 19, а также оценки успешности выздоровления у переболевших.

3. Для выявления ассоциируемости наличия признака «алая/светлеющая кровь» с COVID 19 следует сопоставлять его наличие с такими признаками как наличие IgM к SARS CoV 2 (в течение недели после проведения серологических исследований), повышенное нижнее артериальное давление (выше нормы, характерной для пациента), аносмия, повышенный уровень пролактина, неврологические нарушения (ассоциируемые с COVID 19) либо любой из перечисленных признаков, удобных для формирования репрезентативной выборки, среди людей сходного возраста/пола.

4. Вариант для работника лаборатории – оставлять 1-2 мл цельной крови в пробирках с антикоагулянтом, оценивать удельную долю пробирок с алой кровью в конце рабочего дня и выяснять сопутствующие показатели у людей с такой кровью (наличие -отсутствие IgM на SARS CoV2, буферная емкость или газы крови, пролактин, повышенный уровень ионизированного кальция, ферритина, АСТ/АЛТ, СОЭ, лимфопения или эозинопения, тромбоцитопения или дисперсия данных показателей, в сравнении с индивидами попадающими в сходные поло-возрастные группы).

5. Сравнивать друг с другом следует не менее 20 пробирок (при меньших количествах проб существует проблема с поиском эталонных образцов, четко охарактеризуемых как позитивный и негативный). Не использовать для анализа пробирки с признаками гемолиза или сомнительные пробы. При помещении пробирок в холодильник возрастает интенсивность связывания гемоглобина с кислородом. При первичном анализе следует избегать помещения пробирок в холодильник. Но для усиления контрастности, после первичного учета, можно перемешать кровь и поместить пробирки в холодильник на 30-40 минут

6. Ассоциируемость алой крови с качественными показателями можно оценивать методом четырехпольных таблиц. Ассоциируемость с количественными показателями можно оценивать путем анализа статистической значимости различий по Манну Уитни

7. При необходимости инструментальной оценки можно провести измерение крови на спектрофотометре при 660/910нм (OD 660 максимально для дезоксигемоглобина, OD 910 максимально для оксигемоглобина) записав оптические плотности при 660 и 910нм цельной крови.

Повышенная скорость/эффективность накопления оксигемоглобина в эритроцитах, ассоциируемая с SARS CoV 2

Основной тезис – у людей зараженных SARS CoV2 венозная кровь приобретает цвет артериальной (алой) крови, через 2-3 часа при комнатной температуре.

История вопроса. Обнаружение этого явления носит случайный характер, обусловленый добавлением 2-х мл крови в акутейнеры с ЭДТА/гепарином, объемом 5-10 мл. Традиционно, вакутейнеры заполняются кровью полностью и отсутствие воздушной подушки препятствует появлению этого эффекта. В процессе серологических исследований лиц с признаками ковида, ПЦР позитивных на SARS CoV2 и клинически здоровых (было исследовано ~600 проб), пробы крови с алеющей/светлеющей кровью встречались преимущественно у больных или недавно переболевших COVID 19 людей. Возникла гипотеза о спектральном сдвиге, вызванном накоплением карбоксигемоглобина (кровь имеет более алый оттенок и в этом случае). Действительно, у людей COVID 19 описано повышение уровня карбоксигемоглобина и угарного газа, под действием гемоксигеназы [1], в процессе разрушения гемоглобина (c образованием биливердина, высвобождением свободного железа и усилением воспаления [2], возможным ингибированием CYP 450 и т.д.). Коллеги болеющие COVID 19 и Long COVID анализировали свою кровь в частных лабораториях, уровень карбоксигемоглобина был действительно несколько повышен, на фоне алой крови, однако, эти значения не превышали норму для здоровых курильщиков (с нормальной кровью). Этот факт, а также то, что кровь изначально имеет нормальный цвет и изменяется со временем, заставили отказаться от гипотезы связанной с карбоксигемоглобином. Также следует отметить, пробирки с алой кровью характеризовались большим поглощением при 420 нм (это характерно для оксигемоглобина). Данные наблюдения были сделаны во время 1-2 волн COVID 19.

Вторая гипотеза состояла в повышенной активности карбоангидразы, коэкспрессия этого фермента с ACE2 и неприлина, при заражении SARS CoV2, была показана в научной литературе [3]. На текущий момент она является основной, но нельзя исключить и других причин повышенного транспорта кислорода в эритроциты (включая изменения в мембранах эритроцитов, структуре гемоглобина).

Цель исследований: предложить методологию промежуточного скрининга проб крови в КДЛ, подразумевающую селекцию больных с повышенным риском вирусоносительства COVID 19, позволяющую, при минимальных затратах времени и ресурсов снизить инцидентность внутрибольничного заражения.

Материалы и методы:

Для исследований использовали кровь коллег с различным COVID статусом (клинически здоровые, клинически больные, привитые и непривитые). Ассоциируемость с COVID 19 у людей с клиническими признаками респираторной инфекции обосновывалась положительными результатами ПЦР тестирования индивида или совместно живущих с ним людей с идентичными симптомами за ограниченный период времени, или сероконверсией повле появления первых признаков заболевания (n=89). Одна из лабораторий принимающих участие в данном инициативном проекте проводила оценку встречаемости алой крови только у клинически здоровых людей (n=104). Еще одна лаборатория проводит оценку такой крови преимущественно у госпитализированных больных в ковидных отделениях (информация о результатах еще не поступила).

Для тестирования отбирали 1мл крови из вены и вносили в вакутейнер с ЭДТА. Кровь перемешивали и оставляли при комнатной темепарутре на 3 ч.

Оценка изменения цвета проводилась визуально. Для минимизации субъективности визуальной оценки использовалось фотографирование (с интервалом 3 часа при идентичных условиях освещения), отбор проб крови в две пробирки (в соотношении 1:5) с большой воздушной подушкой и отсутствием оной и ранжирование образцов крови по цвету (не менее 10). Классификация образцов проводилась комиссионно.

У людей с алой и нормальной кровью были взяты образцы плазмы и протестированы на наличие антител класса М и G к фрагменту белка N SARS CoV2.

Данные обрабатывали методами вариационной и непараметрической статистики, качественные данные анализировани методом четырехполных таблиц odds ratio (OR) и χ 2 Уровень статистической значимости оценивали по Фишеру.

Результаты наблюдений:

За период с середины июня по 09 июля 2021 г. в г.Новосибирске было отобрано 58 образцов крови, в том числе в динамике. У больных алая кровь встречалась в 4,6 раз чаще, чем у здоровых. У клинически здоровых пропорция была обратной – алая кровь встречалась в 1,7 раза реже, чем нормальная (таблица 1, рисунок 1). OR =8.09, то есть риск наличия заражения у человека с алой кровью выше в 8 раз. P=0.00004. Хи² = 21,482, p (точный двухсторонний критерий Фишера)=0,000006. Возраст у тестируемых варьировал от 29 до 65 лет. Кровь отбиралась в трудовых коллективах находящихся в состоянии резкого роста заболеваемости СOVID 19 а также у родственников.

Таблица 1 - Наличие алой крови у больных и здоровых, чел.

Рисунок 1 - Удельная доля людей с алой кровью среди больных и здоровых, % (данные лаборатории №1)

Представляет интерес сопоставления результатов с вакцинацией. Все привитые прививались только ГамКовидВАК. Статус «вакцинированный» получал человек через 2 недели после второй вакцинации. В том числе, в выборку попали 5 человек с ПЦР подтвержденным COVID 19, через 4-6 месяцев после второй вакцинации. Всего было обследовано 64 человека.

Как следует из таблицы 2 и рисунка 2 у людей, привитых против COVID 19 алая кровь встречалась в 11% случаев, в то время как у непривитых – в 63,4% т.е. 5,39 раз реже. OR = 8.27 (p=0.0091). Хи 2 12,650, р(F) = 0,00037 Коэффициент сопряженности (С по Пирсону)=0,353, что указывает на наличие умеренной связи между иммунологическим статусом (относительно COVID 19) и цветом крови.

Таблица 2 - Наличие алой крови у привитых и непривитых, чел.

Рисунок 2 - Удельная доля людей с алой кровью среди вакцинированных и невакцинированных, % (данные лаборатории №1)

Критерии отбора проб крови в лаборатории №2 подразумевали работу с людьми без признаков COVID 19, повышенной температуры, респираторной симптоматики или иных COVID ассоциированных симптомов. Учет результатов проводился в т.ч. с привлечением сотрудников лаборатории №1. Как следует из данных таблицы 3 и рис. 3, алая кровь у случайной, клинически здоровой выборки встречалась реже в 3,22 раза. Представляет интерес, что в выборке лаборатории №2 в группу с алой кровью попали муж и жена.

Таблица 3 - Наличие алой крови у больных и здоровых, чел.

Рисунок 3 - Удельная доля людей с алой кровью среди неблагополучных по COVID 19 групп (лаборатория №1) и только клинически здоровых людей, % (данные лаборатории №2)

На текущий момент, протестированные в ИФА люди, с алой и нормальной кровью, характеризуются статистически незначимым увеличением средней концентрации иммуноглобулинов класса М и отсутствеим каких либо различий в отношении иммуноголобулинов класса G.

Рисунок 4 - Результаты ИФА на наличие иммуноглобулинов класса М и G к фрагменту N белка SARS CoV2 у людей с алой и нормальной кровью, S/P, (M + SD).

К вопросу о разделении крови на «алую» и «нормальную». Да следует признать необходимость объективной инструментальной оценки. С другой стороны, в лабораторной практике нередко проводят выбраковку гемолизированных или хилезных образцов крови, руководствуясь виузальной оценкой. Следствием такой визуальной оценки может быть повторное взятие образца и/ или тестирование, с целью выявления факторов связанных с такими визуальными изменениями.

Даже фотографирование достаточно большого количества образцов позволяет увидеть довольно резкие, без промежуточных переходов (ообычно), различия в цвете крови.

Тем не менее, и в случае фотографирования, различия в освещении, используемом фотоаппарате и настройках позволяют добиваться разной степени контрастности.

Однако, можно ометить достаточно четкую кластеризацию образцов классифицированных как «норма» и «алая» кровь при сравнении достаточного количества проб крови.

Индивидуальная оценка образцов бредставляет большие трудности (все же и в том и другом случае – кровь красная), но может быть решена фотографированием или сравнением двух пробирок с кровью но с разным объемом воздушной подушки.

Рабочая гипотеза – повышенный уровень карбоангидразы приводит к ускоренному разложению углекислоты (в условиях малого содержания углекислого газа и кислорода в воздушной подушке), последующему защелачиванию и росту тропности гемоглобина к кислороду. Следует помнить что этот фермент работает в оба направления и, в тканях, может быть обратный процесс – ускоренное образование углекислоты, локальный метаболический ацидоз, выведение бикарбонатов и катионов через почки и т.д. Если речь идет о стимуляции карбоангидразы за счет тканевой гипоксии, то из этого вытекает факт наличия таковой гипоксии и у бессимптомных носителей. Если экспрессия карбоангидразы повышается в ответ на воздействие вируса, то таковое воздействие обязательно затрагивает костный мозг.

Выводы:

1. Разные специфические, для SARS CoV2, критерии такие как наличие IgM или вакцинация пртив COVID 19 ассоциирующиеся с алой кровью дает основание считать, что такое изменение цвета крови может быть патогномоничным для вирусоносительства

2. Подобные изменения возможны только при системных реакциях организма или системном воздействии SARS CoV2 на организм (впрочем, нам встречались и расслоившиеся по цвету пробы у недавно переболевших). То есть речь должна идти о виремии, в т.ч. бессимптомной или токсемии.

3. Наибольшую ценность представляет возможность, за счет чисто организационных мер в КДЛ (обрабатывающих огромные объемы образцов крови), своевременно направлять на дополнительное тестирование людей с алой кровью (IgM, ПЦР тестирование мазка из носа и кала, резервная щелочность, рН, газы крови, аммиак и ионы аммония, кальций ионизированный, ферритин), ограничивать попадание таких людей в общие палаты и, в итоге, снизить риски вспышек COVID 19 в больницах и поликлиниках. Возможно, мы не правы, однако, потенциал и массовость такого подхода создает перспективы масштабного улучшения ситуации

4. Нужен как минимум метод инструментальной верификации визуального анализа (даже засовывание вакцтейнера с алой и нормальной кровью в пульсоксиметр – дает разницу).

5. Совершенно неочевидно – имеем ли мы дело с адаптивной реакцией или все же это следствие негативного и системного воздействия вирусного агента на организм (полезно узнать какого).

Литература:

1. Kwong, Kenneth K; Chan, Suk-Tak. The role of carbon monoxide and heme oxygenase-1 in COVID-19.// Toxicol Rep; 7: 1170-1171, 2020.

2. Abraham N.G., Kappas A. Pharmacological and clinical aspects of heme oxygenase. Pharmacol. Rev. 2008;60:79–127. doi: 10.1124/pr.107.07104.

3. Reza Zolfaghari Emameh, Reza Falak, and Elham Bahreini Application of System Biology to Explore the Association of Neprilysin, Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE2), and Carbonic Anhydrase (CA) in Pathogenesis of SARS-CoV-2// Biol Proced Online. 2020; 22: 11. Published online 2020 Jun 19. doi: 10.1186/s12575-020-00124-6