Рекомбинантная вакцина от коронавируса с оксидом графена в качестве носителя
(Nano coronavirus recombinant vaccine taking graphene oxide as carrier)
Патент CN112220919A, Китай
Изобретатель: 崔大祥高昂梁 辉田 静李雪玲沈 琦
Текущий правообладатель: Шанхайский Национальный инженерный исследовательский центр и компания Nanotechnology Co Ltd.
2020-09-27. Заявка подана Шанхайским национальным центром инженерных исследований для компании Nanotechnology Co Ltd.
Абстрактный
Изобретение относится к области наноматериалов и биомедицины и относится к вакцине, в частности к разработке ядерно-рекомбинантной нано-вакцины против коронавируса 2019-nCoV. Изобретение также включает способ получения вакцины и применение вакцины в экспериментах на животных. Новая вакцина от короны содержит оксид графена, карнозин, CpG и новый вирус короны RBD; связывание карнозина, CpG и RBD неокоронавируса на основе оксида графена; кодирующая последовательность CpG представлена как SEQ ID NO 1; Новый коронавирус RBD относится к новой области связывания рецептора белка коронавируса, которая может генерировать специфическое антитело с высоким титром, нацеленное на RBD в организме мыши, и обеспечивает сильную поддержку для профилактики и лечения нового коронавируса.
Классификации: A61K39 / 12 Вирусные антигены
Описание
Рекомбинантная вакцина от коронавируса с оксидом графена в качестве носителя.
Техническая область
Изобретение относится к области наноматериалов и биомедицины и относится к разработке платформы для разработки вакцины. В частности, к разработке ядерной рекомбинантной нано-вакцины против коронавируса 2019-nCoV. Изобретение также включает использование вакцины в испытаниях на животных.
Техническая область
Вакцина является лучшим оружием для устранения основных инфекционных заболеваний, имеет преимущества самой низкой стоимости и большего количества преимуществ по сравнению с предыдущим врагом, чем другие методы лечения, несомненно, дает надежду общественности, оспа устраняется людьми посредством вакцинации, случаи полиомиелита сокращаются. на 99 процентов инфекционные заболевания, такие как дифтерия, становятся редкими, а заболеваемость такими болезнями, как корь, столбняк новорожденных и т.п., значительно снижается. Влияние вакцин на здоровье человека не является чрезмерным, и рождение каждой новой вакцины - это большая победа человека в борьбе с инфекционным заболеванием! На сегодняшний день никакое медицинское лечение не могло оказать такого важного, длительного и глубокого воздействия на здоровье человека, как вакцина;
После возникновения эпидемии SARS-CoV-2 различные лаборатории в Китае завершили изоляцию штаммов вируса, и, чтобы сделать большой шаг вперед в разработке вакцины, мы считаем, что скоро у нас будет последнее оружие для искоренения вируса. Однако SARS-CoV-2 до сих пор не было одобренной вакцины или лекарства для лечения инфекции CoV, и существует большая потребность в разработке эффективного лекарства для лечения или предотвращения коронавирусной инфекции и вспышки.
Согласно исследованиям вакцин против коронавируса, таких как SARS и MERS, основной целевой точкой существующей вакцины против коронавируса является S-белок коронавируса. Вакцины должны вызывать не только гуморальные и клеточные иммунные ответы, но и иммунные ответы слизистых оболочек, а также с помощью адъювантов для индукции сбалансированных путей Th1 и Th2 для производства действительно эффективных вакцин. В настоящее время исследования большего количества вакцин против SARS и MERS в основном сосредоточены на вирусных векторных вакцинах и субъединичных вакцинах, и большое количество исследований показывает, что трудность SARS и MERS заключается в том, что невозможно стимулировать В-клетки долговременной памяти для генерации, клетки долговременной памяти у излеченных пациентов с SARS и MERS могут сохраняться только в течение 2-3 лет, иммунологическая память не может быть сгенерирована, и это вызывает сбой в разработке вакцины.
Раскрытие изобретения
Изобретение направлено на создание рекомбинантной вакцины против коронавируса.
Другая цель изобретения – предоставить способ получения вирусной рекомбинантной вакцины.
Еще одна цель настоящего изобретения – обеспечить использование рекомбинантной вакцины вируса.
Принимая во внимание различные проблемы обычных вакцин в настоящее время, вопрос о том, как изменить проблемы существующих вакцин и усилить иммунный ответ, всегда рассматривается для улучшения иммунокомпетентности иммуногена и повышения способности иммунного ответа тела, самый простой метод – это смешивание иммуногена с адъювантом, а иммунный адъювант представляет собой промотор, способный усиливать иммунный ответ организма на иммуноген. CpG-олигодезоксинуклеотид (ODN) – очень многообещающий адъювант, открытый в последние годы. Было показано, что CpG ODN обладает лучшей адъювантной активностью in vivo, in vitro и в клинических исследованиях на животных, и лучшими исследованиями являются CpG7909 и CpG 1018. 11 / 9.2017, Вакцина против гепатита В, одобренная Dynavax Technologies FDA Соединенных Штатов Америки и использующая CpG1018 в качестве адъюванта, присутствует на рынке, является первой одобренной адъювантной вакциной CpG ODN в мире и используется для предотвращения инфекции HBV у взрослых 18 лет и старше. старше, и множество различных типов CpG ODN используются в качестве адъювантов во множестве клинических испытаний. CpG сочетается с TLR9 для активации незрелых клеток pDC и индукции естественного и адаптивного иммунного ответа, но одна структура CpG имеет ограниченный активационный эффект на иммунные клетки и легко подвергается быстрому гидролизу экзонуклеазой, так что стабильность CpG in vivo составляет недостаточен, а также возникают побочные эффекты; CpG-олигодезоксинуклеотид (ODN), синтезированный в последовательности, также может усиливать стимулирующий эффект.
Графен представляет собой двумерный углеродный наноматериал, состоящий из атомов углерода на sp-гибридизированных орбиталях в гексагональной сотовой решетке. Основной структурной единицей материала является наиболее стабильное бензольное шестичленное кольцо в органическом материале, и этот материал в настоящее время является наиболее идеальным двумерным материалом. Оксид графена (GO) является производным оксида графена и представляет собой расслоенный продукт. Благодаря характеристикам уникальной гибридизации SP2, идеальной двухмерной структуре и высокой реакционной способности края, лечебная платформа на основе гибридной структуры может использоваться в качестве идеального носителя нагрузки и прививки при проектировании и разработке и играет важную роль. в аспектах систем доставки нанолекарств, биологического обнаружения, лечения опухолей, визуализации клеток и т. п.
Настоящее изобретение было выполнено на основе вышеупомянутых исследований.
В изобретении раскрывается совершенно новый способ разработки вакцины на основе материала оксида графена, служащего каркасом для загрузки молекул CpG и рекомбинантных белков. На основе технической платформы готовится новая нанокоронная вакцина путем комбинирования рекомбинантного белка области RBD с белком Spike SAR-CoV-2. Приготовленная нанокоронная вакцина имеет более высокую иммуногенность в экспериментах на мышах и может генерировать антитела с высоким титром.
В одном аспекте изобретение обеспечивает вакцину против коронавируса, содержащую оксид графена, карнозин, CpG и RBD. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина называется вакциной GO-Car-карнозин-CpG-RBD.
Оксид графена (GO) представляет собой оксид графена, и после окисления кислородсодержащие функциональные группы на оксиде графена увеличиваются, так что оксид графена более активен, чем графен. Например, гидроксильные группы и эпоксидные группы случайным образом распределены на монолите оксида графена, в то время как карбоксильные группы и карбонильные группы вводятся на краю монолита. Обычные коммерческие продукты оксида графена имеют вид порошка, хлопьев и растворов коричнево-желтого цвета.
Карнозин, известный под научным названием β -аланил-L-гистидин, представляет собой твердое кристаллическое вещество, состоящее из дипептида, состоящего из двух аминокислот, β-аланина и L-гистидина. Карнозин обладает сильной антиоксидантной способностью и может улавливать активные формы кислорода (АФК) и альфа-бета-ненасыщенные альдегиды, которые образуются в результате чрезмерного окисления жирных кислот в клеточных мембранах во время окислительного стресса.
Мотивы CpG обладают эффектом активации иммунной системы организма и могут использоваться в качестве адъювантов. Предпочтительно кодирующая последовательность CpG представлена как SEQ ID NO 1.
RBD (домен, связывающий шип рецептора), в частности, рецепторный домен связывания (RBD) белка коронавируса (S-белок) в настоящем изобретении. Например, белок RBD можно выбрать следующим образом:
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAP (SEQ ID NO: 2).
Вакцина против коронавируса, раскрытая в изобретении, получена путем комбинирования карнозина, CpG и нового RBD коронавируса на активированном оксиде графена.
Дозировка ГО в вакцине против коронавируса, предлагаемой в изобретении, используется в качестве основы каркаса, доза обычно является чрезмерной, а доза карнозина может быть примерно вдвое больше, чем дозировка ГО. CpG и новый коронавирус RBD используются в качестве биологических макромолекул, а дозировка CpG и нового коронавируса RBD меньше и обычно составляет одну десятитысячную от дозировки GO по массе. И RBD используется в количестве, более чем в 2 раза превышающем количество CpG, например CpG: RBD = 1: 2-10, предпочтительно, дозировка RBD в 3-6 раз превышает дозировку CpG.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения вакцины против коронавируса, который включает стадии:
получение CpG, рекомбинантного белка RBD и карнозина;
добавление лиофилизированного порошка GO в фосфатный буферный раствор и проведение ультразвуковой обработки;
добавление EDC и NHS для активации раствора GO, удаление избытка EDC / сульфо-NHS в реакционном растворе посредством ультрафильтрации и доведение pH реакционного раствора до нейтрального;
добавление рекомбинантных белков карнозина, CpG и RBD в реакционный раствор, инкубация с активированным ГО;
избыток неконъюгированного белка удаляли из реакционного раствора и стерилизовали для использования.
Предпочтительно продолжительность ультразвука составляет от 2 до 3 часов. Ультразвуковые условия были 200 Вт, 40 кГц.
Предпочтительно фосфатный буфер имеет нейтральный pH, например, от 6,8 до 7,6, более предпочтительно от 7,0 до 7,4 или 7,2.
Предпочтительно методом удаления избытка EDC / сульфо-NHS или неконъюгированного белка является ультрафильтрация.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соотношение оксида графена, карнозина, CpG и RBD составляет: 26 мг: 40 мг: 1,2. мкг: (3-6) мкг.
Предпочтительно температура реакции составляет 20-28 ° C. Например, используется комнатная температура.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вакцину GO-кар-карнозин-CpG-RBD получают следующим способом: GO связывали с карнозином с использованием модификации реакции EDC-NHS, 26 мг лиофилизированного порошка GO добавляли к 5,20 мл фосфатного буфера (PBS, pH = 7,4) и обработали ультразвуком (200 Вт, 40 кГц) при 25 ℃ в течение 3 часов. Раствор GO активировали добавлением 6,82 мг EDC (N1- ((этилимино) метил-ен) -N3, N3-диметилпропан-1,3-диамин, китайский: 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимид) и 7,73 мг NHS (NN-гидроксисукцинимид) при 25 ℃. Избыток EDC / сульфо-NHS удаляли из реакционного раствора ультрафильтрацией, и затем pH раствора доводили до 7,4. Затем 40 мг карнозина, 1,2 мкг CpG, и различные концентрации рекомбинантного белка RBD добавляли к раствору и проводили реакцию с активированным GO при 25 ° C в течение 2 часов. Впоследствии избыток неконъюгированного белка удаляли из реакционного раствора ультрафильтрацией. Приготовленный продукт маркируется как вакцина GO-Car-карнозин-CpG-RBD. Наконец, раствор вакцины GO-Car-карнозин-CpG-RBD контактировали со стерильным фильтром (0,22 мкм) и хранили в стерильных контейнерах при 4 ° C для последующих экспериментов.
Изобретение устанавливает техническую платформу для приготовления вакцины на основе нанорекомбинантных белков, способную быстро возбуждать иммунную систему человека и быстро производить большое количество профилактических вакцин после подтверждения наличия инфекционных вирусов. Техническая платформа полностью использует свойство, состоящее в том, что поверхность оксида графена снабжена COOH, гидроксильными и другими группами, и использует взаимодействие между пи-пи-связями для сборки скринированного рекомбинантного белка RBD, молекул CpG и карнозина вместе для получения нанорекомбинанта. белковая вакцина на основе оксида графена в качестве каркаса. Вакцина может стимулировать организм к выработке нейтрализующего антитела с высоким титром RBD, нацеленного на SAR-CoV-2, и закладывает техническую основу для предотвращения и лечения коронавирусной инфекции и будущих крупных вспышек подобных эпидемий.
В другом аспекте изобретение обеспечивает применение вакцины GO-Car-карнозин-CpG-RBD, а именно применение вакцины GO-Car-карнозин-CpG-RBD для приготовления лекарственного средства для предотвращения нового коронавируса.
Предпочтительно применение композиции может улучшить иммунитет организмов к новому коронавирусу.
Предпочтительно вакцина GO-Car-карнозин-CpG-RBD может генерировать специфические антитела, направленные на RBD, и титр специфических антител является высоким. В варианте осуществления изобретения вакцина nano neocorona проявляет более сильную иммуногенность в тесте на мышах и может генерировать антитела с высоким титром.
Изобретение имеет такие положительные эффекты, которые:
Разработана совершенно новая техническая платформа вакцины для загруженной каркасом молекулы CpG и рекомбинантного белка на основе материала оксида графена в сочетании с рекомбинантным белком области RBD белка Spike SAR-CoV-2 для получения нового нанокоронавируса. В вакцине в организме мыши могут быть созданы специфические антитела с высоким титром, нацеленные на RBD, и оказывается серьезная поддержка для профилактики и лечения нового коронавируса.
Рисунки
Чтобы более четко проиллюстрировать технические решения в вариантах осуществления настоящей заявки, чертежи, которые необходимо использовать в вариантах осуществления, будут кратко описаны ниже, и очевидно, что чертежи в следующем описании являются лишь некоторыми вариантами осуществления настоящего применение, и специалистам в данной области очевидно, что без творческих усилий можно получить другие чертежи.
ИНЖИР. 1 представляет собой схематическую диаграмму и временную диаграмму иммунизации мышей вакциной GO-Car-карнозин-CpG-RBD;
ИНЖИР. 2 показано изменение специфического антитела RBD в сыворотке через 28 дней после иммунизации мышей и изменение продукции цитокинов клетками селезенки через 42 дня после иммунизации мышей.
Подробное описание
Технические решения в вариантах осуществления настоящей заявки будут четко и полностью описаны ниже, и следует понимать, что описанные варианты осуществления являются только частью вариантов осуществления настоящей заявки, а не всеми вариантами осуществления. Все другие варианты осуществления, которые могут быть выведены специалистом в данной области из представленных здесь вариантов осуществления без каких-либо творческих усилий, должны подпадать под объем защиты настоящей заявки. Способы и методики, не описанные конкретно, могут быть выполнены с использованием методов, традиционно известных в данной области техники. Например, обратитесь к справочнику по молекулярному клонированию Cold Spring Harbor.
Пример 1
Процесс получения вакцинного препарата рекомбинантного белка оксида графена (GO) -карнозин-CpG-RBD
Выбор последовательности нуклеиновой кислоты рецептора TLR9 CpG ODN M362, которая имеет перекрестную реакцию как с человеком, так и с мышью, при этом конкретная последовательность имеет следующий вид: 5'-TCGTCGTCGTTC: GAACGACGTTGAT-3 '(25-мерный, SEQ ID NO 1), связывание GO с карнозин с использованием модификации реакции EDC-NHS, 26 мг лиофилизированного порошка GO добавляли к 5,20 мл фосфатного буфера (PBS, pH = 7,4) и обрабатывали ультразвуком (200 Вт, 40 кГц) при 25 ℃ в течение 3 часов. Раствор GO активировали добавлением 6,82 мг EDC (N1- ((этилимино) метил-ен) -N3, N3-диметилпропан-1,3-диамин, китайский: 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимид) и 7,73 мг NHS (NN-гидроксисукцинимид) при 25 ℃. Избыток EDC / сульфо-NHS удаляли из реакционного раствора ультрафильтрацией, и затем pH раствора доводили до 7,4. Затем 40 мг карнозина, 1,2 мкг CpG, и различные концентрации рекомбинантного белка RBD добавляли к раствору и проводили реакцию с активированным GO при 25 ° C в течение 2 часов. Впоследствии избыток неконъюгированного белка удаляли из реакционного раствора ультрафильтрацией. Приготовленный продукт маркируется как вакцина GO-Car-карнозин-CpG-RBD. Наконец, раствор вакцины GO-Car-карнозин-CpG-RBD контактировали со стерильным фильтром (0,22 мкм) и хранили в стерильных контейнерах при 4 ° C для последующих экспериментов.
Пример 2
Тест на мышах, иммунизированных вакциной рекомбинантным белком оксидом графена (GO) -карнозин-CpG-RBD
6-недельных самок мышей BALB / c иммунизировали подкожной инъекцией через 0, 14 и 28 дней, соответственно, в течение 28 дней и 42 дней в соответствии со схемой, показанной на фиг. 1 кровь собирали путем взятия крови в точке, а сыворотку отделяли и тестировали на наличие специфических антител против RBD. Мышей умерщвляли через 42 дня, выделяли спленоциты и тестировали на специфические Т-клеточные иммунные ответы и секрецию цитокинов.
Группирование и определение дозы иммунизированных мышей:
1. (оксид графена + карнозин) + 1,2 мкг cpG + 3 мкг RBD
(оксид графена + карнозин) + 1,2 мкг cpG + 6 мкг RBD
3. Гидроксид алюминия + 6 мкг RBD (1: 1)
4. 6 мкг RBD
5. Липосома (липо) + 6 мкг группы RBD
Штаммы мышей: BALB / c mic (n = 6).
График иммунизации мышей вакциной GO-Car-карнозин-CpG-RBD следующий: кровь собирали и сначала иммунизировали в качестве отправной точки для иммунизации мышей. И (5) сбор крови во второй раз на 7-й день и проверка новой системы добавления вируса короны для усвоения принципа. Третий сбор крови на 14 день, повышение иммунитета. Сбор крови в четвертый раз на 28 день, повышение иммунитета, обнаружение антител в сыворотке и, если положительный результат, подготовка к сбору клеток селезенки. Пятый сбор крови на 42 день, после чего кровь забивали, выделяли спленоциты и подвергали цитокиновым экспериментам.
Результаты испытаний показывают, что группы из 3 мкг и 6 мкг вакцины GO-Car-карнозин-CpG-RBD генерируют специфические антитела с высоким титром для RBD после иммунизации мышей, а вакцина GO-Car-карнозин-CpG-RBD значительно отличается от вакцины. группа традиционного адъюванта, группа RBD и группа липосом (рис. 2). Дальнейший анализ специфического иммунного ответа Т-клеток, отделенных от селезенки, показывает, что вакцина GO-Car-карнозин-CpG-RBD может стимулировать организм к выработке специфических цитокинов IFN-гамма, улучшать иммунитет организма и сопротивляться эпидемическая ситуация нового коронавируса.
Вышеприведенное описание предназначено только для конкретных вариантов осуществления настоящей заявки, но объем настоящей заявки не ограничивается этим, и любые изменения или замены, которые могут быть легко поняты специалистами в данной области техники в рамках технического объема настоящего раскрытия. должны быть охвачены в рамках настоящей заявки. Следовательно, объем защиты настоящей заявки подлежит объему защиты формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Шанхайский нанотехнологический и прикладной национальный центр инженерных исследований, ООО
<120> Нано-новая рекомбинантная вакцина против коронавируса с использованием оксида графена в качестве носителя
<130> 20200920
<160> 2
<170> Патент в версии 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственная последовательность
<400> 1
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 2
<211> 192
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственная последовательность
<400> 2
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1 5 10 15
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
20 25 30
Валь-Ала-Асп Тир-Сер-Валь-Леу-Тир-Асн-Сер-Ала-Сер-Фе-Сер-Тре-Фе
35 40 45
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr
50 55 60
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln
65 70 75 80
Иль Ала Про Гли Глн Тр Гли Лис Иле Ала Асп Тюр Асн Тир Лис Лей
85 90 95
Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
100 105 110
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
115 120 125
Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
130 135 140
Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
165 170 175
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
180 185 190
Претензии (10)
1. Вакцина против коронавируса, в которой указанный коронавирус содержит оксид графена, карнозин, CpG и новый домен связывания рецептора коронавируса; связывание карнозина, CpG и новой области связывания рецептора коронавируса на основе оксида графена; кодирующая последовательность CpG представлена как SEQ ID NO 1; новая область связывания рецептора коронавируса относится к области связывания рецептора нового белка коронавируса S.
2. Коронавирус по п.1, в котором коронавирус получают путем связывания карнозина, CpG и области связывания рецептора коронавируса на активированном оксиде графена.
3. Способ получения коронавируса по п.1, включающий этапы:
получение CpG, рекомбинантного белка рецепторной связывающей области и карнозина, где кодирующая последовательность CpG представлена как SEQ ID NO 1;
добавление лиофилизированного порошка оксида графена в фосфатный буферный раствор и проведение ультразвуковой обработки;
добавление EDC и NHS для активации раствора оксида графена, удаление избыточного EDC / сульфо-NHS в реакционном растворе посредством ультрафильтрации и доведение pH реакционного раствора до нейтрального;
добавление карнозина, CpG и рекомбинантного белка рецепторной связывающей области к реакционному раствору и инкубация с активированным оксидом графена;
избыток неконъюгированного белка удаляли из реакционного раствора и стерилизовали для использования.
4. Способ по п.3, в котором продолжительность обработки ультразвуком составляет от 2 до 3 часов.
5. Способ по п.3, в котором фосфатный буфер имеет pH от 6,8 до 7,6.
6. Способ по п.3, в котором способ удаления избытка EDC / сульфо-NHS или удаления несвязанных белков представляет собой ультрафильтрацию.
7. Способ по п.3, в котором количество карнозина в 1,5 или более раз превышает количество оксида графена, количество области связывания рецептора в 2-10 раз превышает количество CpG, и количество CpG составляет один десять. тысячная часть оксида графена, исходя из массового отношения.
8. Способ по любому из пп.3-7, в котором температура реакции составляет от 20 до 28 ° C.
9. Применение коронавируса по п.1, отличающееся тем, что указанная новая вакцина от коронавируса используется для приготовления лекарственного средства для предотвращения коронавируса.
10. Применение по п.9, где коронавирус заставляет организм вырабатывать антитела к рекомбинантным белкам рецепторсвязывающего домена.